摘要
由新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ， SARS-CoV-2 )感染引起的新冠病毒疾病-19(Corona Virus Disease 2019 ， COVID-19)大流行已对全球公共卫生安全造成重大影响。截止2023年4月，全球已经有逾7亿人感染新冠病毒。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)专家预测，新冠病毒有可能长期存在并持续威胁人类社会，因此，研究开发抗新冠病毒药物具有重大意义。本人在攻读硕士学位期间，针对两种新冠病毒关键蛋白酶，即木瓜样蛋白酶(papain-like protease, PLpro)和主蛋白酶(main protease，Mpro)，进行了小分子药物的筛选和活性研究，现分别介绍如下： 第一部分：靶向新冠病毒PLpro的先导化合物发现与生物活性研究 新冠病毒PLpro是一种半胱氨酸蛋白酶，是病毒复制过程中必须的蛋白水解酶，其通过识别与切割新冠病毒多聚蛋白前体的三个位点，完成非结构蛋白nsp1、nsp2和nsp3的释放。此外，PLpro还是一种去泛素化酶(Deubiquitinase， DUB)，可去除宿主蛋白的泛素化修饰，从而实现对宿主细胞天然免疫反应的抑制。因此，靶向抑制新冠病毒PLpro，能够抑制新冠病毒的复制并同时阻碍其免疫逃逸，被认为是开发抗新冠病毒药物的重要靶点之一。目前，国际上针对PLpro开发的靶向小分子抑制剂较少，且大部分是GRL0617的结构衍生物，化学结构单一，大多数分子细胞内抗病毒活性较低。本部分的研究目的是筛选具全新结构的PLpro抑制剂，为后续靶向PLpro的抗新冠病毒药物研发提供先导化合物。 在本研究中，我们首先在大肠杆菌原核系统中表达并纯化了新冠病毒PLpro，然后构建基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET)的新冠病毒PLpro体外酶活性测试系统。利用该测试系统，对本课题组实体化合物库进行筛选，获得了一个结构新颖的小分子苗头化合物Y2152，其IC50为1.91±0.04μM。进一步利用差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry，DSF)检测Y2152对新冠病毒PLpro热稳定性的影响，其ΔTm值为8.19±0.06℃。以上结果表明：Y2152确实为PLpro的抑制剂，其能够结合新冠病毒PLpro并抑制其酶促反应活性。通过将Y2152与新冠病毒PLpro进行分子对接，我们获得了二者可能的相互作用模式。在此基础上，开展了针对苗头化合物Y2152的结构优化，共设计合成49个小分子，其中活性最高的化合物8c展现出优异的PLpro抑制活性(IC50=31±2.1nM),并且还能抑制新冠病毒PLpro水解Ub-ISG15。进一步的细胞毒性评价表明：8c对于正常细胞呈现低毒性。综上，本部分研究为靶向PLpro的抗新冠病毒药物研发提供了良好的先导化合物。 第二部分：靶向新冠病毒Mpro的先导化合物的发现与生物活性研究 Mpro是也是一种半胱氨酸蛋白酶，负责对病毒多聚蛋白前体进行特异性切割，产生13种非结构蛋白(nsp4-16)，在新冠病毒复制中发挥关键作用。Mpro具有的酶切位点与人类蛋白酶不同，这使靶向新冠病毒Mpro的药物可能具有较低的毒性。因此，Mpro同样被认为是开发新冠病毒药物的理想靶点。目前，靶向Mpro的小分子抑制剂已有较多报道，但这些小分子大多存在酶抑制活性或细胞内抗病毒活性较低，药代动力学参数较差等问题。研究开发高活性、低毒性的Mpro的新型小分子抑制剂仍然具有重要意义。 在本研究中，我们利用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化了新冠病毒Mpro蛋白，建立了基于FRET的Mpro小分子抑制剂筛选系统。我们利用该系统，对本课题组实体化合物库进行筛选，发现两个丙肝口服药物：波普瑞韦(Boceprevir)和特拉匹韦(Telaprevir)具有一定的Mpro抑制活性。通过解析Mpro与Boceprevir和Telaprevir的复合物晶体结构，并基于该结构，利用优势片段拼接的理性药物设计与优化策略，共设计合成了32个新型Mpro抑制剂，酶水平抑制活性在7.6-748.5nM之间。我们进一步解析了活性最高的代表性化合物MI-23和Mpro的共晶结构，结果表明小分子作用模式与药物设计思路吻合。随后，我们选取活性最高的20个化合物进行细胞毒性评价，这些分子在所测试的细胞中均显示较低毒性(CC50gt;500μM)。综上，本部分研究为靶向Mpro的抗新冠病毒药物研发提供了良好的先导化合物。 综上所述，本人在攻读硕士学位期间，针对新冠病毒PLpro和Mpro展开了小分子抑制剂的发现研究。获得了具有全新结构的高活性PLpro小分子抑制剂8c和具有全新结构的高活性Mpro小分子抑制剂MI系列分子，为抗新冠病毒创新药物研发奠定了良好基础。
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