摘要
背景及目的 铁死亡是由铁介导的脂质过氧化物（lipid peroxide，LPO）过度累积引起的细胞死亡，是一种非凋亡调节性细胞死亡方式。铁死亡的发生依赖于细胞内不稳定铁池（labile iron pool，LIP）水平和LPO的累积，而肿瘤细胞因异常的生长需求，胞内LIP水平和脂质含量均较高，使肿瘤细胞易发生铁死亡，为铁死亡治疗提供了有利条件。同时，铁死亡是一种免疫原性死亡方式（immunogenic cell death，ICD），该过程会释放肿瘤相关抗原，激活机体抗肿瘤免疫反应。因此，在临床前研究阶段，基于铁死亡的肿瘤治疗方法被广泛关注。然而由于肿瘤细胞内游离铁离子的缺乏、铁死亡抵抗系统的存在和铁死亡伴随的免疫反应时效短等原因，极大地限制了基于铁死亡的肿瘤治疗效率，使该治疗策略的应用面临巨大挑战。 LPO是铁死亡最终执行物，胞内游离铁离子的浓度直接影响肿瘤铁死亡过程中LPO累积，进而显著影响基于铁死亡的肿瘤治疗效率。但是，肿瘤细胞对铁的代谢调节和铁死亡造成胞内铁离子的消耗，进一步降低了细胞内可利用的铁离子浓度，削弱了铁离子催化脂质发生过氧化的效率，进而严重限制了基于铁死亡的肿瘤治疗效率。此外，胞内还存在谷胱甘肽过氧化酶 4（glutathione peroxidase 4，GPX4）相关的铁死亡抵抗系统，肿瘤细胞内高表达的GPX4催化还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）将LPO还原为无毒的脂醇，对LPO进行解毒，也是限制肿瘤铁死亡治疗效果的重要因素之一。 此外，铁死亡引起的免疫反应时效短，导致其无法有效抑制肿瘤转移和复发。发生铁死亡的肿瘤细胞会释放损伤相关分子模式（ damage-associated molecular pattern，DAMP）以招募免疫细胞浸润至肿瘤部位，并激活抗肿瘤免疫反应。但肿瘤细胞自身表达分化群47（cluster of differentiation 47，CD47）“别吃我”信号，抑制抗原递呈细胞（antigen presenting cells，APCs）的吞噬和抗原递呈能力，进而限制抗肿瘤免疫反应的激活。因此，如何同时提高LPO累积量、阻断CD47信号和增强抗原递呈，以解除铁死亡抵抗和削弱免疫抑制，放大抗肿瘤免疫反应，并形成长效免疫记忆以抑制原位瘤、转移瘤和复发瘤的生长，是实现肿瘤消除的关键问题。 现有基于铁死亡的肿瘤联合治疗策略主要通过直接或间接抑制GPX4的表达、增强胞内LPO累积，诱导肿瘤细胞发生铁死亡，无法彻底地解除GPX4对铁死亡的抵抗作用。成簇规则间隔短回文重复序列（ clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/相关蛋白（CRISPR-associate protein，Cas）编辑系统是一种可精准调控肿瘤细胞基因靶点，改变细胞表型，并且可以遗传到子代细胞的基因编辑工具。CRISPR/Cas 编辑系统在单向导RNA（single-guide RNA, sgRNA）的作用下，在靶基因序列中产生双链断裂。通过非同源末端连接和同源定向修复两种修复途径对双链断裂进行修复，实现对靶基因的高效地编辑。因此，CRISPR/Cas9在适合的sgRNA导向作用下，可从基因组源头解除肿瘤铁死亡抵抗和削弱免疫抑制。基于此，在本论文，我们以开发高效的CRISPR/Cas9基因编辑系统的递送系统、解除肿瘤细胞及其子代铁死亡抵抗、提高铁死亡治疗效果为目标，构建了多功能肿瘤微环境（tumor macroenvironment，TME）响应型CRISPR/Cas9纳米递送系统。我们期望通过多功能纳米粒递送系统解除黑色素瘤细胞及其子代细胞GPX4对铁死亡抵抗，联合光动力治疗有效增强黑色素瘤细胞铁死亡，显著增强黑色素瘤治疗效果改善黑色素瘤荷瘤C57B/L6小鼠生存期；进一步，联合免疫治疗，有效解除肿瘤免疫微环境免疫抑制作用抑制原位瘤、转移瘤和复发瘤的生长，实现肿瘤完全清除。本论文为增强肿瘤铁死亡治疗策略提供思路和有效策略。 主要研究内容及结果 针对肿瘤细胞内LIP中游离铁离子水平和铁死亡抵抗系统限制基于铁死亡的肿瘤治疗效率的问题，我们设计并合成了铁离子及自由基供体——光敏剂-铁螯合物修饰的多功能透明质酸（hyaluronic acid，HA），Ce6Fe (III)-HA-PEG-R8RGD，以此为“外壳”；同时通过一步酰胺反应合成了转染材料——氟化的聚乙烯亚胺（fluorinate polyethyleneimine，PF）以及构建了CRISPR-GPX4质粒，二者自组装形成了“内核”；“外壳”和“内核”再自组装形成了多功能TME响应的纳 米 粒 （ Ce6Fe (III)-HA-PEG-R8RGD/PF33/CRISPR-GPX4 ferroptosis nanoparticles ， FERRET/CRISPR-GPX4 ）。FERRET/CRISPR-GPX4 不仅递送CRISPR/Cas9基因编辑系统至肿瘤细胞，敲除GPX4进而抑制LPO还原，还可升高LIP水平并增强自由基反应链的引发和增长，促进LPO生成，实现LPO“疏堵结合”。我们系统研究了在TME中的透明质酸酶（hyaluronidase，HAase）作用下，FERRET/CRISPR-GPX4介导的“疏堵结合”策略增强肿瘤铁死亡治疗的作用和机制。首先，我们考察了该纳米粒的粒径、电位、形貌及HAase响应能力等，结果表明自组装形成的 FERRET/CRISPR-GPX4 具有均一形貌和良好稳定性，并表现出灵敏的HAase响应性。同时，评价了纳米粒在肿瘤细胞中的细胞摄取性能、溶酶体逃逸能力以及转染效率，证明该纳米粒可高效地转染B16-F10肿瘤细胞。接着，对 FERRET/CRISPR-GPX4 在体外抗肿瘤效果及其机制进行了探究，体外研究结果表明FERRET/CRISPR-GPX4通过敲除GPX4和Fe3+消耗GSH还原为Fe2+直接或间接抑制GPX4活性而抑制铁死亡抵抗系统，以“堵”住LPO去路；通过增强游离铁离子浓度而增加铁离子催化脂质过氧化效率，和光动力介导的ROS生成，从而直接或间接增强脂质过氧化反应，增强LPO的生成，即为“疏”策略，进而实现体外高效抗肿瘤效果。最后，对FERRET/CRISPR-GPX4 体内抗肿瘤效果进行了评价，结果表明 FERRET/CRISPR-GPX4 介导的“疏堵结合”策略显著抑制了肿瘤生长，并显著延长了荷瘤小鼠生存期。此外， FERRET/CRISPR-GPX4未表现出明显的系统毒性。 基于上述发现，即铁死亡可有效抑制局部肿瘤的生长，为进一步克服铁死亡无法引起长效的免疫反应而致使肿瘤铁死亡治疗对肿瘤转移和复发疗效不佳的问题，我们又从肿瘤免疫的角度出发，设计并合成了免疫增强的 TME 响应型HA，以此为“外壳”；并且合成了转染材料PF以及构建了靶向两个基因位点的 CRISPR-GPX4-CD47 质粒，PF 和 CRISPR-GPX4-CD47 质粒自组装形成了“内核”；“外壳”和“内核”二次自组装形成了具有肿瘤靶向性、TME响应性和免疫增强功能的可高效递送 CRISPR/Cas9 基因编辑系统的纳米粒（ Nano-militarist）。我们系统性研究了 Nano-militarist 在 HAase 和基质金属蛋白酶 2 （matrix metalloproteinases 2，MMP2）作用下，解除铁死亡抵抗、提高肿瘤细胞LPO的累积水平和加强抗肿瘤免疫反应，进而增强肿瘤铁死亡的能力。首先，我们评价了HAase和MMP2处理前后的Nano-militarist的粒径、电位及形貌以及对质粒的负载能力，结果表明Nano-militarist通过静电吸附形成了稳定、TME响应型纳米粒。接着评价了纳米粒在肿瘤细胞中的细胞摄取性能、溶酶体逃逸能力以及其对肿瘤细胞、DC2.4细胞和Raw264.7细胞的转染效率，结果证明该纳米粒是对肿瘤具有特异转染能力的优良非病毒基因载体。继而评价了 Nano-militarist 对肿瘤细胞、骨髓树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cell， BMDC）、骨髓巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）和脾脏初始T细胞（naïve T cell，Tn）的GPX4和CD47基因突变效率，结果表明Nano-militarist特异编辑肿瘤细胞的GPX4和CD47基因，而不编辑BMDC、BMDM和Tn的GPX4和CD47基因。随后，对Nano-militarist在体外抗肿瘤效果及机制进行了探究，结果表明Nano-militarist通过敲除肿瘤细胞GPX4和CD47，增强肿瘤细胞内LPO累积，介导肿瘤细胞铁死亡，从而发挥体外抗肿瘤作用。接着，我们评价了Nano-militarist处理后的肿瘤细胞对BMDC和BMDM的影响，结果表明Nano-militarist促进肿瘤细胞释放DAMP，增强了BMDC和BMDM的吞噬能力，刺激BMDM的成熟、促进BMDM向M1型巨噬细胞的极化。在B16-F10 黑色素瘤皮下瘤模型中对 Nano-militarist 体内抗肿瘤效果及机制进行了研究，结果表明Nano-militarist通过降低GPX4和CD47的表达介导肿瘤细胞自发铁死亡，同时促进APCs成熟或极化，促进抗肿瘤免疫反应，刺激CD8+T细胞分泌IFNγ，协同促进肿瘤细胞进一步铁死亡，有效地延长了荷瘤小鼠生存期，实现体内高效抗肿瘤治疗。最后，我们研究了Nano-militarist对黑色素瘤术后转移和复发的疗效，结果表明经该纳米粒治疗后，可以通过系统免疫效应和免疫记忆效应抑制黑色素瘤术后转移和复发，同时延长术后转移和复发模型中小鼠的生存期。Nano-militarist在治疗期间是系统性给药，在治疗结束后未检测到炎性因子风暴、重要器官中的靶基因编辑和明显的系统毒性。 结论 在本论文中，我们首先构建了多功能TME响应型纳米粒递送CRISPR/Cas9基因编辑系统，并对多功能 TME 响应型纳米粒增强肿瘤铁死亡治疗效果进行了系统性研究。肿瘤靶向HAase响应型FERRET/CRISPR-GPX4不仅通过提高LIP 水平，增强了脂质过氧化自由基反应链的引发和增长，促进 LPO 的生成，实现LPO“疏”策略；还有效地解除铁死亡抵抗，减少LPO消耗，实现LPO“堵”策略提高LPO的累积。此外，该纳米粒还极大地降低了光敏剂治疗剂量和铁离子介导铁死亡的剂量。该纳米粒介导的“疏堵结合”策略增强了光动力治疗杀伤效率和铁死亡效率，达到了多重增效抗肿瘤治疗的效果。进一步地， Nano-militarist 克服了基于铁死亡的肿瘤治疗中肿瘤细胞抑制免疫细胞抗肿瘤功能的问题。Nano-militarist精准诱导肿瘤细胞发生铁死亡，通过促进APCs浸润、成熟和分化，保护 T 细胞免受铁死亡诱导剂的影响，从而增强抗肿瘤免疫反应，刺激CD8+T细胞分泌IFNγ，协同促进肿瘤细胞继续发生铁死亡，抑制原位瘤、转移瘤和复发瘤生长，从而实现抗体内高效肿瘤治疗。本论文的研究提供了高效的方法以克服肿瘤铁死亡治疗中的关键问题，为肿瘤铁死亡治疗提供了新的研究思路和解决途径。此外，该研究也为其他新型抗肿瘤治疗方案的开发、设计及联合治疗策略提供了理论和实践参考，具有重要的现实意义。
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