摘要
目的： 肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种在组织形态学及分子机制上都具有极大异质性的肿瘤，目前临床上针对 HCC 的分子分型和靶向治疗仍极具挑战性。其中，细胞角蛋白 19（cytokeratin 19，CK19）表达阳性的HCC被认为是一个特殊亚型。CK19作为一个经典的上皮标记物，常用于病理诊断中肿瘤来源的鉴别。在原发性肝癌中，CK19 免疫组化染色常被用于区分HCC和肝内胆管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）。然而，临床研究发现，也有少部分HCC可以异常表达CK19，且其阳性表达与肿瘤转移、耐药、复发相关，与患者预后不良密切相关。文献回顾发现大多数研究都将CK19 作为一个干性标记物和恶性转化的结局指标，其阳性表达的原因和作用机制仍不清楚。事实上，细胞角蛋白作为细胞中的“桥梁”分子，常参与细胞骨架重排、应激保护、物质转运等关键的生物学过程，对于细胞存活和恶性转化十分重要。因此，明确 CK19在 HCC 中异常阳性表达的生物学作用及分子机制，积极探索相应的治疗策略，对于改善HCC患者的预后具有极大价值。 材料和方法： 1、HCC中CK19的表达及其与临床病理特征和预后的相关性：收集299例人HCC组织样本，免疫组化检测CK19表达情况，并以阳性率5%为界值分为CK19阴性和阳性组，进行两组间临床病理特征相关性分析及预后分析。 2、干预 CK19 对 HCC 细胞系恶性表型的影响：构建敲低及稳定过表达CK19的HCC细胞系，进行细胞体外功能实验（CCK-8、克隆形成、EdU染色、划痕、Transwell、干细胞成球、高内涵成像）及裸鼠体内成瘤实验，观察过表达CK19对HCC细胞生物学行为的影响，WB检测相关分子水平。 3、选择CK19灶阳HCC病例进行空间转录组测序，分析筛选同一组织样本中 CK19 阴性/阳性区域差异基因；进一步对阴性对照组和 CK19 过表达组HCC细胞系进行转录组测序，筛选差异基因并进行富集分析确定过表达CK19影响的信号通路，WB、G-LISA等方法验证关键分子及下游信号改变。 4、Co-IP联合质谱分析确定CK19结合蛋白并确定结合位点：利用过表达CK19肝癌细胞系，进行Co-IP实验并进行质谱分析及Duolink PLA实验、免疫荧光染色等，明确与 CK19结合的蛋白，并检测两者结合导致的相关蛋白水平或定位改变。 5、肝脏特异性过表达 CK19 小鼠模型体内验证其功能和机制：构建肝细胞特异性过表达CK19小鼠（Alb-Cre:Krt19LSL/LSL），观察过表达CK19对肝脏的影响；DEN+CCl4诱导Krt19LSL/LSL和Alb-Cre:Krt19LSL/LSL小鼠发生HCC，观察过表达 CK19对小鼠肝癌成瘤率及病理学改变；DEN+CCl4诱导 Krt19LSL/LSL成瘤后使用 AAV-TBG-Cre 在 HCC 细胞中强制性过表达 CK19，观察过表达CK19对肿瘤进展情况。 6、药物敏感性实验寻找CK19阳性HCC潜在的治疗靶点：使用CCK-8、流式细胞术等检测经典与非经典 WNT通路抑制剂对 CK19阳性和阴性细胞的抑制效应；同时建立NOD/SCID同源小鼠移植瘤模型，观察非经典WNT通路抑制剂对CK19阳性HCC细胞耐药的影响。 结果： 1、组化检测299例手术切除HCC组织中CK19蛋白表达发现CK19阳性率为 28.4%，以局部灶阳为主（ 94%） ，假腺样型阳性率最高（ 37.5%）。CK19表达情况与患者临床病理特征进行相关性分析发现，CK19阳性表达与肿瘤大小、PD-L1高表达、瘤栓形成及肿瘤细胞低分化显著相关。生存分析发现肿瘤大小、癌栓形成、有无MVI以及CK19阳性表达与HCC患者更短的总体生存相关，且 CK19阳性与更短的无进展生存相关，与较差的索拉菲尼响应相关。多因素 COX回归分析提示 CK19阳性表达、肿瘤大小、癌栓形成可以作为独立的预后危险因素。 2、使用 siRNA 和慢病毒包装过表达质粒分别构建敲低和稳定过表达CK19的肝癌细胞系，通过 CCK-8、平板克隆、划痕、Transwell、高内涵成像及干细胞成球体外实验，观察到CK19能促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭，而对肿瘤干细胞成球没有明显的促进作用。利用稳定过表达 CK19的 Huh7细胞系，进一步建立裸鼠皮下及肺转移移植瘤模型，发现过表达组肿瘤细胞较对照组在体内增殖活性更高，成瘤生长更快，且更容易形成肺转移灶。 3、人肝癌组织多重免疫荧光染色发现，CK19阳性细胞与EpCAM、SOX9阳性细胞并不完全重合。圈选42个ROI（22个CK19阳性区域vs. 20个CK19阴性区域）进行空间转录组测序，并对439个差异表达基因进行GSEA富集分析，结果提示CK19阳性肿瘤细胞中血管生成、FGF结合、细胞运动和囊泡转运复合体相关信号显著上调，而氧化磷酸化、蛋白运出、内质网应激及未折叠蛋白反应相关信号下调。非经典 WNT与 Hippo通路活化，同时经典 WNT信号抑制性分子上调，提示过表达 CK19肿瘤细胞的恶性生物学行为不依赖经典WNT信号。 4、对过表达CK19前后的HCC细胞系进行转录组测序分析，并对1215个差异表达基因进行聚类分析，结果发现除 MAPK、TGF-β、Hippo 等关键的细胞增殖和分化通路外，非经典 WNT 信号通路也显著激活。WB、钙离子探针及免疫荧光双染进一步验证，过表达CK19可激活WNT/PCP和WNT/Ca2+非经典通路，而不促进β-catenin入核。 5、Co-IP联合质谱分析及PLA实验发现，CK19可与IQGAP1结合，促进IQGAP1及其互作蛋白DVL3在胞浆的定位。过表达CK19可降低DVL3的整体泛素化水平，同时抑制IQGAP1与β-catenin的结合，从而激活非经典WNT信号通路，促进HCC的恶性表型。 6、肝细胞特异性过表达CK19小鼠（Alb-Cre: Krt19LSL/LSL）至8月龄不会自发成瘤；但在化学诱导小鼠肝癌模型中，过表达 CK19可以显著增加肿瘤的体积和数量。HE 显示过表达组更易出现肿瘤中心缺血坏死，肿瘤细胞异型性更明显，多形性肿瘤细胞混杂排列，汇管区炎细胞浸润更明显；组化结果提示过表达CK19并未促进β-catenin入核，但Ki67和SOX9阳性率较对照组明显升高。 7、细胞药物敏感性实验发现，过表达 CK19 并不增加肿瘤细胞对经典WNT 信号抑制剂 MSAB 的反应，但可以明显降低非经典 WNT 通路抑制剂CMZ在 HCC细胞系的 IC50。CMZ处理后，过表达组细胞与对照组相比，细胞周期抑制更明显，细胞侵袭表型被挽救，凋亡更多。 8、CK19阳性 HCC细胞对5-FU、索拉菲尼等 HCC常用的治疗药物更耐受。利用化学诱导小鼠肝癌组织和NOD/SCID小鼠建立同种皮下移植瘤模型，单用索拉菲尼或索拉菲尼联合 CMZ治疗发现，单用索拉菲尼对 CK19阳性移植瘤的生长抑制不明显，而 CK19阴性移植瘤的药物反应更好；联合用药组中， CMZ大大提高了CK19阳性移植瘤对索拉菲尼的敏感性，而CK19阴性组却与索拉菲尼单用疗效类似。 结论： 1、HCC中 CK19阳性表达与肿瘤大小、PD-L1高表达、瘤栓形成及肿瘤细胞低分化相关，可以作为独立的预后危险因素。 2、CK19通过与IQGAP1结合，促进IQGAP1本身及其互作蛋白DVL3在胞浆的定位，同时减少IQGAP1与β-catenin结合，从而激活非经典WNT信号通路，促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性表型。 3、CK19阳性HCC细胞对多种肝癌治疗药物不敏感，但对非经典WNT通路抑制剂反应良好。干预非经典WNT通路有望提升CK19阳性HCC的药物敏感性。
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