摘要
研究背景 根据WHO《2022年全球结核病报告》，当前结核病发病人数和死亡人数的降幅还远达不到预期。报告中指出由于新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019, COVID-19)疫情(以下简称新冠疫情)和耐药结核病的影响，当前结核病(Tuberculosis, TB)的防控难题变得更加复杂。自2019年末新冠疫情以来，公众更加注重卫生防护，在较大程度上阻碍了呼吸道疾病的传播，据调查研究显示，2020年四川省报告的流行性感冒发病率较之前五年的平均水平下降了36.12%。但是，对于像结核病这样的慢性呼吸道传染病，较少有研究探究新冠疫情对其防治的影响。结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)是结核病的病原体，对MTB临床分离株进行分子分型，有助于了解不同病人来源的菌株之间的亲缘关系，探究可能存在的传播途径。当前国内外的耐药结核病问题依旧严峻，对结核分枝杆菌的耐药机制进行研究，有助于应对结核分枝杆菌的耐药问题。基因突变一直被认为是引起结核分枝杆菌耐药的关键因素，但是基因突变并不能解释所有的耐药现象。研究发现，没有发生耐药基因突变的耐药菌株，其耐药性的发生可能是由于菌株外膜中的外排泵的作用。在结核分枝杆菌中，已发现的最具代表性的外排转运蛋白家族有5个，分别是ATP结合盒超家族(ATP-Binding Cassette/ABC Super-Family)、MFS超家族(Major Facilitator Super-Family )、SMR家族(Small Multidrug Resistance Family)、RND家族(Resistance-Nodulation-Cell Division Family)和MATE家族(Multidrug and Toxic Compounds Extrusion Family)。 研究目的 本研究对2017~2021年自贡市结核病报告资料进行回顾性分析，总结近5年当地新发结核病的报告发病率以及类型构成(包括性别、年龄、初复治类型等)的流行规律，同时结合实验室阳检率评估新冠疫情对当地结核报告发病率的影响，对当地结核病的控制提供参考； 对当地的耐药结核分枝杆菌临床分离株进行分子流行病学研究，分析当地耐药结核分枝杆菌的传播范围，以便有针对性地进行防控； 对当地的耐药结核分枝杆菌的耐药机制进行研究，除一般耐药机制即耐药相关基因突变外，还引入了外排泵基因耐药机制研究，初步探讨这两种机制在细菌耐药中发挥的作用。 方法 1、以2017~2021年自贡市在《结核病报告系统》中新登记的结核病人为研究对象，结合当地的人口学资料和实验室检测信息，对登记资料进行回顾性研究。分析当地结核病的人群分布特征(性别、职业、患者来源等)、发病率及发病趋势以及地区分布特征等情况，比较新冠疫情发生前后结核病的流行特征以及实验室阳检率的差异情况，在了解自贡市结核病流行现状的基础上，提出有效的防控策略。 2、以自贡市结核病定点医院分离得到的120株耐药结核分枝杆菌临床分离株为实验对象，包括单耐异烟肼(Isoniazid ， INH )、单耐利福平(Rifampicin，RIF)、耐多药菌株。采用标准MIRU-VNTR12位点法进行分型研究。先用PCR和琼脂糖凝胶电泳对扩增产物的条带大小进行分析，获得菌株不同位点的重复次数；再将数据导入到MIRU-VNTRplus数据库(https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index)，构建系统发育树图和最小生成树；将数据导入到SITVIT2网站(http://www.pasteur-guadeloupe.fr:8081/SITVIT2)，对分离得到的菌株进行全球来源分析；通过位点多态性分析，评价12位点法的分辨能力；通过计算成簇率和近期传播率，分析当地耐药结核病的流行和传播情况。 3、通过PCR对120株耐药菌株，包括单耐异烟肼、单耐利福平和耐多药菌株相关耐药基因进行扩增，再进行Sanger测序，将测序结果用Snapgene软件进行分析，探究自贡市耐药结核分枝杆菌在耐利福平相关基因(rpoB)和耐异烟肼相关基因(katG、inhA、oxyR-ahpC)上的突变情况，分析不同突变位点所占比例，了解自贡市耐药结核分枝杆菌的主要突变位点。 4、运用实时荧光定量PCR技术测定不同候选内参基因的Ct值，再结合geNorm、NormFinder、ΔCT、Bestkeeper和RefFinder这5种分析软件分别对数据进行分析，评价候选内参基因的稳定性，确定用于外排泵基因相对表达量测定时的内参基因。 5、通过实时荧光定量PCR技术和双内参校正法计算5株敏感菌株和41株耐药菌株(单耐利福平5株、包括单耐异烟肼18株和耐多药菌株18株)中外排泵基因的相对表达量；比较不同耐药类型(单耐利福平、单耐异烟肼、耐多药)菌株中，外排泵基因的过表达情况；比较加入外排泵抑制剂(Verapamil, VP)前后结核分枝杆菌耐药谱和药物最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration，MIC)的变化，探讨结核分枝杆菌外排泵基因表达在耐药机制中发挥的作用。 6、采用Kruskal-WallisH秩和检验比较不同耐药类型的临床分离株中外排泵基因表达是否有差别。采用单样本t检验和单样本Wilcoxon符号秩和检验比较药物诱导前后外排泵基因表达量的改变。采用卡方检验分析探讨MIRU-VNTR多态性位点(MIRU26和MIRU31)、耐药基因突变与外排泵基因过表达的关系。 结果 1、2017~2021年，自贡市累计报告结核病6861例，5年报告发病率49.29/10万~60.16/10万，平均发病率为54.11/10万(6861/1267.9万人)。2017、2018、2019及2021年，每年均有2个报告发病高峰，而2020年报告发病高峰集中在9月，但总体报告发病的季节性并不明显。所有报告的患者中，男女患者比例为3.17(5214/1647 )，“农民”是患者的主要职业(占56.64%)，自流井区是自贡市发病率最低的区县，本地户籍是患者的主要户籍类型，占所有患者数的92.06%(6316/6861)；初治患者是患者的主要治疗类型，初治患者与复治患者之比为15.22:1(339423/6438)；就诊延迟率较高的人群是干部职员(72.84%)、复治(73.29%)、因症推荐(88.73%)人群。新冠疫情后，自贡市结核病报告发病率降低(χ2=22.668，Plt;0.001)，同时痰培养(χ2=14.106，Plt;0.001)和Gene-Xpert(χ2=17.225，Plt;0.001)的结核病原检出阳性率均显著低于新冠疫情前。 2、对自贡市120株耐药结核分枝杆菌临床分离株进行MIRU-VNTR标准12位点分型结果显示，方法的总体分辨指数(Hunter-Gaston Index, HGI)为0.974，MIRU26和MIRU31呈现高多态性，MIRU10、MIRU16、MIRU39和MIRU40呈现中等多态性，其余位点即MIRU2、MIRU4、MIRU20、MIRU23、MIRU24和MIRU27呈现低多态性，其中，MIRU2位点的重复单元次数均为2，未表现出多态性。重复次数最集中的位点是MIRU2，重复次数最为分散的位点是MIRU26。MIRU-VNTRplus数据库分析结果显示，120株耐药菌株的MIRU-VNTR分型结果包含78个基因型(13个基因簇和65个独立基因型)，成簇率为45.83%(55/120)，近期传播率为35%(42/120)。最小生成树显示MIRU-VNTR分型结果可以分成三个克隆复合体CC1、CC2和CC3。在SITVIT2网站对这120份有效菌株的MIRU-VNTR结果进行查询，其中有32株菌的12个基因型可以在网站中找到相应的12MIT编号，12个基因型分布于全球五个洲14个国家。 3、120株耐药结核分枝杆菌中，耐利福平菌株(包括单耐利福平菌株和耐多药菌株)的rpoB基因的突变率为78.8%(67/85)，其中最常见的突变是Ser531Leu(36.5%，31/85)和Asp516Val(10.6%，9/85)，同时也存在一些双位点突变情况(16.5%，14/85)；耐异烟肼菌株(包括单耐异烟肼菌株和耐多药菌株)最常见的突变是类型是katG上Ser315Thr(69.3%， 79/114 )和inhA上-15C→T(13.2%， 15/114 )，在所有耐异烟肼的菌株中并未检测到oxyR-ahpC基因上的突变。 4、对内参基因的筛选结果显示，所有候选内参基因Ct值处于23.720(16SrRNA,SD±3.720)至31.466(polA,SD±3.087)之间。geNorm稳定性排序结果为：secA=sigAgt;Hsp65gt;GAPDHgt;sigBgt;rpoBgt;polAgt;16SrRNA；NormFinder稳定排序结果为：secAgt;Hsp65gt;GAPDHgt;rpoBgt;sigAgt;sigBgt;polAgt;16SrRNA；BestKeeper稳定性排序结果为：sigAgt;rpoBgt;secAgt;GAPDHgt;Hsp65gt;sigBgt;polAgt;16SrRNA；ΔCT分析稳定性排序结果为：secAgt;Hsp65gt;GAPDHgt;sigAgt;rpoBgt;sigBgt;polAgt;16SrRNA；RefFinder稳定性排序结果为：secAgt;sigAgt;Hsp65gt;GAPDHgt;rpoBgt;sigBgt;polAgt;16SrRNA。上述分析软件中，secA和sigA都被评估为最稳定表达的基因。 5、采用双内参法对外排泵基因表达情况进行分析，结果显示，100%(5/5)的单耐利福平菌株有过表达的现象，有44.4%(8/18)的单耐异烟肼菌株有过表达的现象，88.9%(16/18)的耐多药菌株有过表达的现象。比较药物诱导前后外排泵基因相对表达量的变化情况，利福平能诱导单耐利福平菌株中2个外排泵基因Rv3065(t=3.115，Plt;0.05)和Rv1250(t=2.899，Plt;0.05)相对表达量的上调，而异烟肼并未诱导单耐异烟肼菌株中外排泵基因相对表达量的上调。在耐多药菌株中，单一RIF诱导下Rv1250(w=-0.653,Pgt;0.05)和Rv1218c(t=0.567,Pgt;0.05)基因表达没有明显改变，但其余外排泵基因相对表达量却在单一RIF诱导后出现了下调；单一INH诱导后，Rv1250(w=-2.613,Plt;0.05)、Rv0876(w=-1.960,Plt;0.05)和Rv0933(t=-2.866,Plt;0.05)相对表达量下调，R1218c相对表达量上调(t=2.326,Plt;0.05)；在RIF和INH共同诱导的条件下，Rv1250(t=-6.179,Plt;0.05)、Rv1819c(w=-2.961,Plt;0.05)以及Rv1218c(w=-2.047,Plt;0.05)相对表达量出现了下调，其余外排泵基因并未出现明显改变。 6、比较外排泵抑制剂VP对不同耐药类型菌株的作用效果，结果表明，VP并未改变所有单耐异烟肼菌株的MIC，但明显降低了敏感菌株(INH:t=7.000,Plt;0.05;RIF:t=3.000,Plt;0.05)和单耐利福平菌株的MIC(RIF:t=3.500,Plt;0.05)，也能降低部分耐多药菌株的MIC(INH:t=2.715,Plt;0.05:RIF:t=3.117,Plt;0.05)。 7、在耐药基因突变和不突变的临床分离菌株中，都可能存在外排泵基因的过表达。比较不同类别菌株中外排泵基因过表达的发生率可以发现，多态性最强的两个位点MIRU26(χ2=0.043,Pgt;0.05)和MRIUR31(χ2=1.406,Pgt;0.05)都与外排泵基因的过表达发生率无关，而发生耐药相关基因突变的菌株比未发生突变的菌株有更高的外排泵基因过表达率(χ2=7.241,P=0.07)。 结论 1、自贡市2017~2021年报告的结核病患者中，农民及中老年男性依旧是结核病防治的重点人群，且结核病患者总体呈现就诊延迟率较高的现象。新冠疫情对结核病患者的类型构成影响不大，但是由于疫情期间阳检率降低，提示存在隐匿患者增多的可能性，不能对结核病报告发病率的下降盲目乐观。在新冠疫情结束后更应该加大宣传和筛查力度，针对高危人群(如农民、中老年男性、糖尿病患者等)加强宣传教育，争取让患者得到最快的诊断及治疗。 2、标准MIRU-VNTR12位点法对于耐药菌株有较好的分辨力，分型结果发现自贡市的耐药结核病存在一定的传播范围，近期传播率较高，提示在今后耐药结核病人管理上还需要加强宣传教育，控制传播范围。MIRU-VNTR“233325173533”型别为自贡市耐药菌株中最主要的流行类型，同时也存在个别独立型的流行。 3、在耐药结核分枝杆菌中，耐RIF相关基因(rpoB)和耐INH相关基因(katG)都有较高的突变率，但仍然存在少部分菌株，未检测出相关耐药基因发生突变；提示rpoB和katG基因可以分别作为利福平抗性和异烟肼抗性的分子检测位点，另一方面也说明已知的耐药相关基因突变并不能解释所有结核分枝杆菌耐药现象的发生。 4、secA和sigA的特异性和扩增效率都符合内参基因的要求，且经过geNorm、NormFinder、ΔCT、Bestkeeper和RefFinder这5种分析软件分析，这两个基因是在给予和不给予药物压力下表达最稳定的基因。因此，选择secA和sigA同时作为后续研究的内参基因。 5、药物诱导并不一定会使所有外排泵基因上调，不同菌株的表现各不相同。总体而言，药物诱导对单耐利福平菌株外排泵基因的表达有较大影响。 6、外排泵抑制剂能够降低部分耐药菌株和敏感菌株的MIC，提示抑制外排泵作用可以提高耐药结核病患者的治疗效果。 7、多态性位点的重复次数与外排泵基因的过表达发生率无关，提示利用分子分型并不能预测外排泵基因的过表达；外排泵基因的过表达和耐药基因突变相关，在发生耐药相关基因突变的菌株中，外排泵基因的过表达率也更高。
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