摘要
目的： 由创伤、感染或肿瘤手术切除导致的严重骨缺损修复一直是临床中亟需解决的难题。尽管人体骨组织有一定自我修复和重建能力，但当缺损较大超过组织自我愈合能力时，需进行干预，否则极可能出现骨不连等严重并发症。自体骨移植和异体骨移植是临床主要治疗方法。其中，自体骨移植一直被认为是治疗骨缺损的“金标准”，疗效显著，但存在诸如供体来源不足、供区疼痛、出血、神经损伤和再发骨折等弊端而使其应用受限。异体骨移植也存在疾病传播和社会伦理等问题而难以得到广泛应用。因此，探寻和研发人工可再生骨移植生物材料对解决骨缺损修复这一难题、促进骨组织工程技术在临床中的实践应用具有重要意义。本研究从仿生骨结构和功能角度出发，制备负载掺锶纳米介孔硼硅酸盐生物活性玻璃(Sr-BGNPs)和血管内皮生长因子(VEGF)的无机-有机多功能复合聚谷氨酸-g-酪胺(PLG-g-TA)水凝胶，通过PLG-g-TA水凝胶填充缺损部位，类细胞外基质(ECM)结构为细胞粘附和向内生长提供空间支持，为Sr-BGNPs提供矿化位点，并减缓Sr-BGNPs的降解和矿化进程，避免VEGF的暴释，实现对功能性离子和VEGF的缓释作用，进一步发挥功能性离子的促成骨与VEGF促成血管的协同作用，提供骨缺损修复的临床可替代方案。 材料和方法： 通过溶胶-凝胶法制备单分散Sr-BGNPs，以L-谷氨酸γ-苄酯为原料合成聚L-谷氨酸，并接枝酪胺得到PLG-g-TA聚合物，在辣根过氧化物酶(HRP)与过氧化氢(H2O2)作用下原位交联制备PLG-g-TA水凝胶，通过负载Sr-BGNPs和VEGF，最终制备PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs复合水凝胶。首先通过扫描电镜(SEM)观察Sr-BGNPs的形貌和粒径，观察水凝胶的形貌和孔径；傅里叶变换红外光谱(FTIR)、X射线衍射(XRD)和X射线光电子能谱仪(XPS)分析Sr-BGNPs的官能团、物相组成和表面元素分布；核磁共振氢谱(1H NMR)和FTIR检测PLG-g-TA聚合物结构。然后通过小瓶倒置法检测水凝胶成胶性能和成胶时间，动态流变学检测水凝胶在成胶时间动力学、剪切应变和频率扫描不同模式下的储能模量(G’)和损耗模量(G’’)。最后通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)和ELISA分别测试离子和VEGF的释放，评价体外矿化和缓释性能。 体外实验分Blank、PLG-g-TA、PLG-g-TA/VEGF、PLG-g-TA/Sr-BGNP和PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs五组。首先从10天龄SD乳鼠的胫骨提取、培养并鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs),对Sr-BGNPs和PLG-g-TA行生物相容性测试。随后Blank和各水凝胶组分别与rBMSCs和人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)共培养，通过SEM观察细胞在材料表面的粘附和生长；CCK-8和划痕实验检测材料促细胞增殖和迁移能力；碱性磷酸酶(ALP)和茜素红S(ARS)染色检测材料促成骨分化能力；成管实验检测材料促血管形成能力；细胞免疫荧光染色检测材料促成骨相关蛋白骨形态发生蛋白2型(BMP-2)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和Ⅰ型胶原(COL I)的表达；RT-PCR检测促成骨、成血管相关基因BMP-2、RUNX2、ALP和VEGF的表达。最后用核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)因子诱导小鼠单核巨噬细胞系(RAW 264.7)破骨分化，并与Blank组和各水凝胶组共培养，通过鬼笔环肽/DAPI和抗酒石酸酸性磷酸酶(Trap)染色检测材料抑制破骨细胞分化成熟的能力，通过牛骨片甲苯胺蓝染色检测材料抑制破骨细胞骨吸收的能力，通过RT-PCR检测材料抑制破骨细胞分化成熟相关基因NFATc1、MMP9、Trap和c-Fos表达的能力。 体内实验分组同体外实验，首先通过大鼠皮下注射水凝胶，检测材料在体内的降解性和安全性。然后构建大鼠5mm直径颅骨骨缺损模型，植入各组水凝胶8周后处死大鼠并获得颅骨标本，通过X线、Micro-CT等术后影像学检测评价新生骨量，通过HE和Masson染色评价新生骨生成，通过Trap染色评估新生骨区域破骨细胞的活性，通过多色荧光染色评估新生骨区域表达成骨相关蛋白BMP-2和RUNX2的阳性细胞百分比和CD31标记的新生血管数量，通过顺序性荧光染色标记新生骨评估各治疗组在各时间点的新生骨量。最后通过心、肝、脾、肺和肾HE染色评估材料的体内安全性。 结果： 成功制备粒径70-100nm、Zeta电位为-13.04±0.33mV的单分散中空介孔球形Sr-BGNPs(70SiO2-10B2O3-14CaO-6SrO)，经模拟体液(SBF)浸泡能矿化形成羟基磷灰石(HA)，周围环境为碱性(pH＞7.4)。小瓶倒置法和成胶动力学确定构建水凝胶的聚合物终浓度固定5%(w/v)，HRP浓度固定8units/mL，H2O2与苯酚上羟基摩尔比0.4，体积比为2:1:1。水凝胶呈现三维蜂窝状连续大孔，平均孔隙率为60.38±1.18%，孔径80-100μm，G’达13566Pa，有良好体外降解性。通过成胶动力学、剪切应变和频率扫描测试确定后续制备复合水凝胶的Sr-BGNPs含量为5%(w/v)，复合水凝胶G’达26127Pa，能经SBF浸泡矿化形成HA，能缓释功能性离子(Si、Ca、B、Sr)和VEGF，并维持周围环境碱性。 体外实验首先通过流式分析和三系分化鉴定证明提取rBMSCs为干细胞并具有多向分化潜能。CCK-8、活死染色、溶血实验、细胞吞噬TEM验证Sr-BGNPs和PLG-g-TA的体外生物相容性良好；RBMSCs在各组水凝胶表面共培养48h后，SEM见细胞在各材料表面均匀铺展，伸出大量伪足，细胞形态良好；细胞增殖和划痕实验结果显示，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组促细胞增殖和迁移能力均最强；体外促成骨诱导分化ALP和ARS染色结果显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组成骨诱导效果最强；体外成管实验显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组小管形成数、连接数、总长度和总面积均最高；免疫荧光染色结果显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组表达最多的成骨相关蛋白，如BMP-2、RUNX2和COLI；RT-PCR结果显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组表达最多与成骨、成血管相关的基因，如BMP-2、RUNX2、ALP和VEGF。抑制破骨方面，鬼比环肽、Trap染色和牛骨片甲苯胺蓝染色显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs能有效抑制RANKL因子诱导Raw264.7破骨分化，抑制破骨细胞的骨吸收能力。RT-PCR结果显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组能有效抑制与破骨细胞分化成熟相关基因的表达，如NFATc1、MMP9、Trap和c-Fos。 体内实验显示水凝胶在皮下8周可完全降解，未引起周围组织病变。术后8周，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs复合凝胶能有效促进大鼠颅骨骨缺损的修复重建，X线和Micro-CT结果显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组缺损部位内有最多的新生骨，半定量分析结果均优于其他组；HE和Masson染色证实PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组能有效促进缺损部位内新生骨形成；Trap染色结果显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组较PLG-g-TA和PLG-g-TA/VEGF组能显著减少破骨细胞数量、抑制破骨活性；多色荧光染色结果显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组修复区表达成骨相关蛋白BMP-2和RUNX2的阳性细胞占比率最高，同时CD31标记的新生血管数量也最多；顺序荧光染色结果显示PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组在术后不同时间荧光标记的新生骨量均最多。主要脏器HE染色结果显示材料的体内安全性良好。 结论： 本研究成功制备了负载Sr-BGNPs和VEGF的无机-有机复合功能化聚谷氨酸水凝胶(PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs)。其具有良好的体内外生物安全性、可降解性，通过降解释放功能性离子和VEGF，可有效促进细胞增殖和迁移，展现强大的促成骨和促成血管生成能力，同时还可抑制破骨细胞分化及骨吸收能力，在大鼠颅骨骨缺损模型中应用时展现出优异的修复效果，是一种有应用前景的人工可再生骨移植生物材料。
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