摘要
摘要 背景 胰腺实性假乳头状瘤(solid pseudopapillary tumor，SPT)是一种罕见的胰腺外分泌肿瘤，仅占胰腺肿瘤的1%左右，不表达与胰腺发育和分化相关的分子。虽有研究报道β-catenin异常表达引起的Wnt信号通路激活与SPT发生密切相关，但SPT的发病机制仍不明确。目前，SPT在临床上常用β-catenin进行诊断，但仍常被误诊为胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine tumor， PNET)。精确区分SPT和PNET是临床上的一个难题。因此，急需深入解析SPT的分子特征，有助于SPT的精准诊断和治疗。 近年来，高通量测序技术的发展为肿瘤生物学研究提供了新的技术支持，空间转录组测序技术是一项新兴前沿技术，可以保留组织空间位置并同时解析组织转录组信息。本研究旨在通过空间转录组测序，从新的角度研究SPT的分子特征，为SPT的诊断和治疗提供新思路。 方法 1.数据收集及测序：从四川大学华西医院分别收集2例SPT和2例PNET患者手术切除的新鲜离体样本，并进行10XVisium空间转录组测序。 2.数据预处理：(1)使用LoupeBrowser软件对组织学图像进行手动比对，选定组织区域和背景区域；(2)使用SpaceRanger软件将原始测序数据与GRCh38参考基因组进行比对，生成原始的基因表达矩阵。 3.空间转录组测序数据聚类：(1)使用Seurat进行数据过滤，保留高质量的Spot进行后续的分析；(2)用Seurat进行降维、聚类，再根据病理注释进行组织区域划分；(3)通过经典标记基因的表达和拷贝数变异，判断组织区域划分的准确性。 4.细胞类型注释：(1)使用FindAllMarkers函数筛选每个Cluster中的差异表达基因；(2)根据胰腺各细胞类型经典标记基因的打分及每个Culster的差异基因确定主要细胞类型；(3)采用ESTIMATE和GO功能富集分析，鉴定细胞注释的准确性。 5.SPT肿瘤组织的特征分析：(1)使用FindMarkers函数分析SPT肿瘤组织与癌旁正常组织之间的差异表达基因；(2)使用monocle2进行拟时序分析，重塑细胞随着时间的变化过程；(3)使用GSVA进行基因集变异分析；(4)使用CellphoneDB2鉴定细胞间的相互作用。 6.SPT与PNET之间的差异表达基因分析：(1)使用Seuratmerge函数合并SPT与PNET的肿瘤组织测序数据；(2)使用FindMarkers函数进行差异基因分析；(3)使用clusterProfiler对差异表达基因进行富集分析。 结果 1.通过绘制空间转录组层面的SPT细胞类型图谱，发现SPT正常细胞以腺泡细胞为主，成纤维细胞以块状集中分布在肿瘤组织的边缘，肿瘤组织免疫浸润较少，证明了SPT肿瘤是“免疫荒漠型”。SPT肿瘤组织不表达胰腺标记物，无法确定其谱系来源。此外，我们还发现SPT存在正常组织向肿瘤组织过渡的交界区域。 2.拟时序分析表明SPT从以腺泡细胞为主的正常组织逐渐进展成为肿瘤细胞。从正常组织到交界区域再到肿瘤组织的轨迹，腺泡细胞标记基因的表达逐渐降低，提示腺泡细胞可能去分化成为SPT肿瘤细胞。 3.差异表达基因分析显示，CCN3在SPT肿瘤组织中显著高表达，并沿着从正常组织发展到肿瘤组织的轨迹表达量逐渐升高。CCN3能够激活NOTCH信号通路，进而上调NOTCH信号通路下游靶基因(HES和HEY)的转录，我们也发现HEY1在肿瘤组织中显著高表达。GSVA分析进一步证实了SPT中NOTCH信号通路的激活。通过细胞通讯分析，发现了JAG1-NOTCH2、JAG1-NOTCH3在SPT肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与成纤维细胞之间通过相互作用发挥作用。这些结果提示NOTCH信号通路的改变可能是SPT发生发展的重要环节。 4.通过鉴定SPT与PNET肿瘤组织的差异表达基因，发现CCN3在SPT肿瘤组织中的表达丰度比目前临床上用于SPT诊断的CTNNB1水平更高，且CTNNB1在两例PNET中均有较高表达，但CCN3在PNET表达量很少。这些结果提示CCN3是潜在的SPT诊断标志物。 结论 本研究绘制了SPT的空间转录组图谱，发现其为“免疫荒漠型”肿瘤，并通过拟时序分析重塑了腺泡细胞去分化发展成肿瘤细胞的轨迹，为SPT来源于腺泡细胞的假说提供了支持。本研究从全新的角度解析了SPT的分子特征，发现CCN3显著上调可能通过激活NOTCH通路与SPT的发生发展密切相关，并提出CCN3可能是比CTNNB1更可靠的SPT临床诊断标志物。因此，本研究为SPT的发生发展提供了新的见解，为SPT诊断和治疗提供了实验数据。
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