摘要
高温大曲是糖化发酵剂，也是“微生物工厂”，其品质好坏决定了酱香型白酒的风味和质量，高温大曲是由白曲、黄曲和黑曲组成，按照最佳配制比例混合后，使得大曲在整体上达到优质曲的稳定生产效果。大曲的发酵是多种微生物共同作用的结果，优势微生物对其贡献更大。因此，研究高温大曲的黑、白、黄三种大曲的理化、挥发性成分和微生物组成差异，探究三者之间的相关性并解析优势微生物，监测大曲中优势微生物的生长情况对及时评估大曲发酵情况、保证大曲的连续稳定生产和提升白酒品质具有重大意义。本论文以两个产区大曲的黑、白、黄三种为研究对象，以两个酱酒核心产区大曲为样本，分析理化、特征风味成分和微生物结构差异，归纳指标的关联性和优势细菌，并构建了2种快速检测优势微生物的方法。 本文主要内容如下： 1．以高温大曲的黑、白、黄三种大曲为研究对象，测定了理化指标和主要酶系、挥发性成分，分析不同产区三种大曲的理化性质差异、特征挥发性成分。实验结果表明：茅台产区的高温大曲水分高于郎酒产区；两产区的大曲酸度都呈现黑曲最高、黄曲最低的趋势，且郎酒产区酸度普遍更高；两产区的中性蛋白酶为白曲最高、黑曲最低的趋势，且茅台产区的蛋白酶的活性皆高于郎酒产区，且酯化力和糖化力也有同种趋势。白曲的吡嗪类物质的浓度明显高于黑曲和黄曲，可作为白曲的特征风味成分；黄曲的醇类和酸类物质都高于白曲和黑曲。酸类物质中浓度较高的是乙酸、异戊酸；醇类物质中2,3-丁二醇、苯乙醇浓度较高，酮类物质中乙偶姻浓度较高；醛类成分以苯乙醛为代表。乙酸、2-戊醇和庚酸乙酯为黄曲的特征风味物质，黑曲中2,3-丁二醇浓度为特征风味物质；四甲基吡嗪和三甲基吡嗪是白曲的特征风味物质。不同产区同种大曲在挥发性成分多样性上的差异远小于同一产区内的黑、白、黄曲之间的差异。 2. 以组成高温大曲的黑、白、黄三种大曲为研究对象，测定了两个产区不同曲种的细菌群落结构，解析不同曲种的优势微生物，并进行了理化指标、挥发性成分和微生物的关联分析。结果表明：在属水平上郎酒产区中黑曲和黄曲的优势属是Bacillus；Rhodanobacter、Virgibacillus和Bacillus为郎酒白曲优势属；茅台黑曲的优势属是Phyllobacterium；茅台黄曲的优势属是Phyllobacterium和Bacillus，茅台产区白曲中Bacillus为优势属。茅台产区的细菌多样性多呈现黄曲最高、白曲最低的趋势，郎酒产区呈现白曲的细菌多样性普遍高于和黄曲和黑曲的趋势，不同产区之间同种大曲的差异比同一产区的不同曲种细菌多样性差异略小。所有大曲样品最优势的属是 Bacillus。细菌与常见的理化指标相关性最强的细菌依次有 Bacillus 和Kroppenstedtia，吡嗪类物质最密切相关的菌种是Bacillus。 3．构建了ARMS-qPCR快速检测大曲中优势微生物的方法。根据ARMS原理和解淀粉芽孢杆菌的基因序列设计了 12 条引物，筛选确定出一条有效的特异性引物12F-1R。使用该引物设计灵敏度实验，发现本方法的最低检出限LOD为656 CFU，可以实现定量检测。利用与解淀粉芽孢杆菌高度相似的枯草芽孢杆菌为背景菌，两种菌株混合进行掺比实验，结果表明本方法可以检测 1%的解淀粉芽孢杆菌。选取 5种大曲中常见的其他芽孢杆菌为背景菌进行特异性检测，结果表明本方法可以特异性检出解淀粉芽孢杆菌。本方法检测时间为90min，在短时间内即可获得结果。相较传统的平板计数法法，基于ARMS-qPCR的检测方法大大减少了误差，节省了时间，能够实现快速、高效的监测大曲中优势微生物的生长情况，及时控制大曲的质量。 4．研究了一种基于 CRISPR/Cas12系统的优势微生物检测方法。利用 ARMS技术设计的错配引物来区分亲缘性高的芽孢杆菌，CRISPR/Cas12 系统用于鉴定扩增产物，以提高核酸检测的特异性，以报告基团的荧光信号来判断结果。实验以 ARMS-PCR技术扩增出的双链DNA作为目标DNA，设计10条gRNA并筛选最佳gRNA特异性识别扩增位点，确定了 gRNA3为最佳 gRNA，此时信噪比最大。通过原理验证确定了检测系统的可行性。通过优化 gRNA、reporter 浓度和循环数来优化反应条件，当Cas12蛋白与gRNA浓度比值为1：2，Cas12蛋白与reporter浓度1：10，循环数为 25X 时，信噪比最大。通过灵敏度实验结果表明本方法检测解淀粉芽孢杆菌的检出限 LOD 为 651CFU。通过特异性实验结果表明本方法可以特异性检测解淀粉芽孢杆菌。模拟大曲固态发酵实验表明，与传统 PCR 方法对比，本方法可以更准确的监测大曲中解淀粉芽孢杆菌的生长情况。本方法检测时间为60min，不需要依赖昂贵的大型仪器，能对优势微生物进行物种水平监测。
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