摘要
由人工进化的高活性腺嘌呤脱氨酶(TadA8e和TadA9)与识别不同PAM的Cas蛋白(SpCas9n和SpCas9n-NG)融合的高效腺嘌呤碱基编辑器(adeninebaseeditor,ABE)rB46b、rBE49b、rBE50和rBE53在水稻品种kit(Oryzasativaspp.Japonica)中以近似100％的编辑效率实现了腺嘌呤A到鸟嘌呤G的替换，现阶段ABE可以用于水稻内源基因定向进化以创造理想的种质。然而已有研究表明碱基编辑器在基因组中会造成一定程度的脱靶事件，并且目前缺乏高效ABE介导的水稻脱靶的相关研究，本研究利用全基因组测序(Whole-genomesequencing，WGS)和转录组技术系统研究了rB46b、rBE49b、rBE50和rBE53在kit基因组的脱靶情况。 水稻白叶枯病原菌小种抗性基因Xa10在水稻中表达能够赋予水稻对Xoo的全生育期抗性。然而只有携带AvrXa10的病原物小种才能激活Xa10的表达使水稻抗病。目前对Xa10的利用仅限于在Xa10启动子中插入几种TALE效应因子识别元件以扩宽水稻对Xoo的抗性谱。组成型表达的启动子(如35S启动子)介导的Xa10过表达会导致水稻植株生长发育异常并死亡。已有研究报道AtTBF1基因在转录和翻译水平上受到的严格调控使其能够控制拟南芥的生长与防御平衡。为了更好利用Xa10来创制广谱抗病性材料，本研究利用OsTBF1基因的启动子和5’非编码区共同调控Xa10表达，来创制广谱抗Xoo和Xoc(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)且农艺性状极少受到破坏的水稻新种质。 首先为了探究高效ABE是否会引起水稻基因组的脱靶，以rB46b、rBE49b、rBE50和rBE53载体为实验组，无农杆菌组培实验(C1)和空载体农杆菌组培实验(C2)为两个阴性对照组，进行农杆菌介导的水稻遗传转化。随机选择54个水稻T0植株进行全基因组测序分析，结果发现这些ABE对靶点sgRNA具有高度特异性，几乎不产生sgRNA依赖型脱靶突变。进一步分析sgRNA非依赖型脱靶事件，发现对照组C1和C2的T0植株中鉴定出大约200-400个脱靶单核苷酸变异(singlenucleotidevariation,SNV)和大约250-350个小片段插入或缺失(insertionanddelection，Indel),而递送了高效ABE系统的实验组T0植株中鉴定到大约200-800个SNV和200-500个Indel。其中含有SpCas9n-NG的植株产生了类型更丰富的SNV,含有TadA9的植株则产生了更多的A＞G脱靶突变。深入分析发现ABE引起的目的基因靶向突变可以发生在T-DNA整合到植物基因组之前和之后的整个过程中，而非靶点基因脱靶事件则更多发生在T-DNA整合到水稻基因组之后。此外，对SpCas9n-TadA8e和SpCas9n-TadA9转化获得的T0植株进行转录组测序，分析发现RNA脱靶事件的发生与ABE的表达量成正相关，与DNAA＞G脱靶突变位点的随机性相比，RNAA＞G脱靶突变趋向于成簇存在，并且RNA脱靶会随着ABE转基因元件在T1代植株中的分离而减少。以上结果表明高效ABE在水稻中基因编辑的特异性与Cas蛋白的种类，TadA的变体种类，以及ABE的表达时间和表达量密切相关。 为了调控Xa10表达以赋予水稻广谱抗病性并且尽可能降低对水稻农艺性状的不利影响，本研究首先利用EGFP作为标记基因进行荧光观察和qPCR试验，证明在转化OsTBF1p-OsuORF-EGFP的水稻愈伤中，OsTBF1-OsuORF组合对EGFP表达的抑制作用更强。在此基础之上，本研究利用农杆菌介导的水稻遗传转化技术将OsTBF1p-OsuORF-Xa10递送到kitaake中获得一系列T0转基因植株，表型观察发现这些T0植株株高增加，进一步接种分析发现它们对PXO99A具有不同程度的抗病性。随后对具有中度抗性的T0植株进行进一步的扩繁和抗病表型鉴定，结果显示T1代纯合植株株高、穗长和单株穗重增加、且对45个Xoo和25个Xoc小种具有显著增强的抗病性。这些结果表明，可以利用OsTBF1p-OsuORF组合调控Xa10表达的策略来生产具有广谱抗病性且产量增加的水稻抗病新种质。
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