摘要
荷斯坦牛是全世界公认的产奶量最高、产奶经济型最高的奶牛品种。与猪、禽等繁殖能力强的动物不同，牛的繁殖效率低、世代间隔长，因此奶牛育种工作主要是通过长期系统的选育进行群体遗传改良。在以冷冻精液和人工授精为主导技术的奶牛繁育体系中，一头优良的种公牛每年承担上万头母牛的配种，可快速将优秀种公牛基因引入到种群，因此公牛精液的冻后活力尤为重要。精子的耐冻性是影响精液冻后活力的关键。已有研究报道解冻后的精子活力在不同公牛之间存在显著差异，且公牛精子解冻后精子活力性状的遗传力约为0.21，属于中等遗传力。因此从遗传水平挖掘影响精子耐冻性的关键基因和分子标记具有重要意义，为提高种牛精子耐冻性提供理论依据。 本研究基于种公牛站长期收集的精液冻前和冻后活力表型记录，筛选精液高耐冻组公牛（n=9）和低耐冻组公牛（n=6）。两组个体的鲜精精子总活力均≥63％,而解冻后总活力分别为≥40％（高耐冻组）和≤27％（低耐冻组）。利用超速离心法从精浆中提取精浆胞外囊泡（SPEVs），并通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析以及Westernblot等方法对其进行形态、粒径以及标志蛋白的鉴定。使用Label-free技术分别对精子细胞和SPEVs进行蛋白质组测序，以挖掘影响精子耐冻性的重要蛋白质。结果显示高耐冻组和低耐冻组精子和SPEVs中分别鉴定到432和394个差异表达蛋白（DEPs）。加权基因共表达网络分析（WGCNA）结果显示，一个模块与精子耐冻性显著正相关（r=0.89,P=9×106）;一个模块与精子耐冻性显著负相关（r=-0.76,P=0.001）。对差异表达蛋白进行GO和KEGG分析，结果显示与精子能量代谢密切相关的“代谢途径”和“氧化磷酸化”是主要的生物过程。此外，通过比对动物数量性状基因座数据库发现，17个DEPs同时位于解冻后精子活力相关的QTL区间内。此外，高耐冻组和低耐冻组中共有142对精子和精浆胞外囊泡的蛋白在两组中显著相关（|r|＞0.9,P＜0.05）。基于上述研究结果，挑选9个精子耐冻性重要候选基因TEX101、STK38、VAMP3、HSP90B1、LPO、DASE2、CUTA、HSPA1A和LY6K在高低组中进行PCR混池测序，检测候选基因遗传变异，并在99头公牛群体中进行关联分析，最终发现位于HSPA1A内的三个SNPs与精子耐冻性显著相关。 本研究全面检测和分析了不同耐冻性的公牛精子和SPEVs的蛋白质组学特征，挖掘到了一批重要候选基因并利用生物信息方法初步阐述了其影响精子耐冻性的生物学通路和分子机制。同时，鉴定到HSPA1A中的3个重要SNPs可以作为区分公牛精子耐冻性能的潜在生物标志物，研究结果为提高我国种公牛的精子耐冻性提供了重要理论依据。
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