摘要
刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）引起的弓形虫病是世界范围内感染最为常见的人畜共患寄生虫病之一。现阶段针对弓形虫复合多价疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等研究较多，但只能诱导部分保护力，因而，目前针对该病原体在人医领域尚无有效疫苗可用，兽医仅适用于绵羊。弓形虫的抗原具有多源性、复杂性、虫株类型和生活周期特异性，在现阶段还未能发现有效和持久的免疫保护抗原。研制出能够产生有效且全面的免疫保护力，同时具有明朗应用前景的弱毒疫苗在当下弓形虫病防治工作中具有现实意义。 通过文献筛查和生物信息学分析，我们筛选了多种可能具有弱毒疫苗研发潜力的基因。锁定了GRA72和RASP1对于弓形虫体外生长适应性无关的毒力相关基因。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，我们尝试以Ⅰ型RH虫株和Ⅱ型ME49虫株为背景来构建基因缺失株。通过基因敲除，成功构建了RHΔRASP1虫株和RHΔGRA72虫株，以开展基本生物学特性和突变株疫苗研究。通过体外增殖实验和噬斑实验发现，RHΔRASP1虫株虽然噬斑数量显著减少，但胞内增殖能力与野生株无显著差异;而RHΔGRA72虫株体外增殖能力无异于野生株，但体外培养时其纳虫空泡形态显著异常。在小鼠感染实验中，我们用100个RHΔRASP1虫株速殖子感染小鼠，35天后仍有50％小鼠存活，虫株毒力表现显著降低;RHΔGRA72虫株速殖子感染小鼠，其存活时长延至17天但小鼠最后均死亡，说明敲除GRA72后RH虫株仍然具有较强的毒力。而后，以100个RHΔRASP1虫株免疫小鼠，35天后再次感染弓形虫速殖子进行攻毒实验，以腹腔注射100个RH速殖子，再次感染的小鼠在35天后存活率达90％;同时，我们也进行了Ⅱ型虫株进行攻毒，每只小鼠口服灌胃10个ME49包囊，这些小鼠35天后全部存活，进行脑包囊计数发现包囊数量显著减少。这些实验结果表明RHΔRASP1虫株在小鼠免疫模型中能够对弓形虫的再次感染具有很好的免疫保护效果。 综上所述，本研究通过CRISPR/Cas9技术以RHΔku80为背景虫株成功构建弓形虫GRA72和RASP1基因缺失虫株，分析了虫株的生物学基本功能，证实RASP1敲除株具有弱毒苗株的潜力。这项工作为后续在猫体内开展弓形虫基因缺失株疫苗研制奠定了前期基础。
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