摘要
20世纪60年代，通过大量引入矮秆基因Rht而实现小麦产量和抗倒伏能力大幅提升的农业改革活动“绿色革命”，是小麦育种的一次重大突破。然而，研究表明绿色革命矮秆基因Rht不利于目前小麦单产的进一步提升，主要表现为在小麦粒重性状方面具有负效应。因此，挖掘与Rht相关的小麦粒重基因并解析其调控粒重形成的分子机制，可以为进一步提高小麦产量提供思路和理论基础，并为设计和培育大粒型绿色革命小麦新品种提供重要的基因资源。本研究通过反向遗传学的方法获得了一个影响籽粒发育的YABBY类转录因子TaDL。通过分子生物学、遗传学和生物化学等方法，揭示了TaDL基因在小麦中的生物学功能以及调控粒重的分子机制。主要研究结果如下: 1.表达模式分析结果显示，TaDL的转录本在雌蕊、外稃、幼穗和早期籽粒中表达丰度较高，并且TaDL-4A、TaDL-4B和TaDL-4D三者在不同组织中存在表达分化现象;TaDL在籽粒发育早期高丰度表达，随着籽粒发育的进行，表达量呈下降趋势。原位杂交结果显示，TaDL在胚乳细胞、传递层细胞、维管束、果皮淀粉体和种皮部位均有表达。 2.TaDL-4B存在不同的转录本，在籽粒发育过程中表达丰度较高的转录本是TaDL-4B.1、TaDL-4B.4和TaDL-4B.5;并且随着籽粒发育的进行TaDL-4B.1在全部转录本的比例逐渐增加，TaDL-4B.4的比例逐渐减少。转录活性分析结果显示，TaDL-4B具有转录激活活性，不同转录本之间的转录活性存在差异。TaDL-4B的转录本形式影响了其亚细胞定位，TaDL-4B.1和TaDL-4B.4的编码蛋白主要定位于细胞核中，TaDL-4B.5定位于细胞核以及细胞质和细胞膜上的斑点状结构中。 3.利用CRISPR/Cas9基因编辑系统和转基因技术创制了Tadl突变体系，TaDL-4A/4B/4D同时突变的株系（Tadl#1、Tadl#2）严重矮化，茎秆发育异常，无芒，穗长变短，小穗数降低、小穗变小且无法结实;双突变体（Tadl-b/d、Tadl-a/b）育性正常，与受体材料Fielder相比，株高不变，千粒重、粒长和粒宽均显著降低。双突变体（Tadl-b/d、Tadl-a/b）胚乳细胞化后分裂增殖异常，胚乳组织增生过程受阻。TaDL-4B.4超表达株系茎秆变粗，小穗变大，基部小穗发育较完整，千粒重及粒宽显著增加。 4.通过比较Fielder和Tadl双突变体（Tadl-b/d、Tadl-a/b）6DAP时期籽粒的转录组信息发现，10个GA合成基因在突变体中下调表达;激素测定结果显示，突变体中活性GA水平降低。外源GA3处理可以部分恢复突变体粒重降低的表型，并且在8-12DAP时期，GA处理后细胞周期相关基因在突变体中上调表达，与对照材料Fielder的表达趋势不同。通过EMSA实验证明，TaDL-4B.4可以直接结合在GA20ox3-3B和GA3ox2-2B.1启动子的GARE元件上。通过双荧光素酶系统证明，TaDL-4B.4可以激活GA20ox3-3B和GA3ox2-2B.1转录。 5.以DL-4B.4编码序列作为诱饵蛋白进行互作蛋白筛选，获得了一个细胞周期相关蛋白NEK6-6B。荧光素酶互补、双分子荧光互补、免疫共沉淀和酵母双杂交实验证明DL-4B与NEK6-6B存在物理互作关系。体外磷酸化实验证明NEK6-6B对DL-4B有磷酸化修饰作用;蛋白稳定性实验证明NEK6促进DL-4B蛋白积累。利用CRISPR/Cas9系统创制了Tanek6突变体系（Tanek6#1和Tanek6#5），与Fielder相比，突变体的千粒重、粒长和粒宽显著降低。突变体胚乳细胞增殖和细胞扩张受到抑制，胚乳组织发育过程异常。 6.通过荧光素酶互补和酵母双杂交实验证明，与Rht-B1a编码的DELLA相比，DL-4B与Rht-B1b编码的DELLA互作更强。不同时期籽粒的动态表达分析结果显示，TaDL、TaNEK6、TaRht-B1b在8-10DAP时期具有相似的表达趋势。通过酵母三杂交实验证明，Rht-B1b编码的DELLA可以作为分子桥与DL-4B、NEK6-6B形成三元复合物。双荧光素酶系统证明Rht-B1b编码的DELLA通过与DL-4B互作降低GA信号的产生。体外磷酸化实验证明Rht-B1b编码的DELLA抑制NEK6-6B对DL-4B的磷酸化修饰作用。 7.根据小麦重测序信息，在TaDL-4B启动子上游-4464bp和-3800bp位置发现2处SNP变异。通过对486份冬麦种质资源的变异类型进行分析，将其分为3种单倍型。通过启动子活性分析实验发现，Hap1（CC）和Hap2（TT）的活性显著高于Hap3（TC）。其中，Hap1和Hap2类型材料的穗长显著高于Hap3;Hap2类型材料的千粒重、粒长和粒宽显著高于Hap3。优势单倍型Hap1和Hap2占全部材料的24％,在国内栽培品种中占比为20％。
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