摘要
开花植物的授粉受精过程是有性生殖中不可或缺的途径，而有性生殖则是进化和环境适应中至关重要的一部分。雄配子体（花粉）的正常发育对授粉受精过程尤为重要，花粉壁是植物雄配子体表面包裹的致密层，由外壁和内壁组成，其中外壁主要由外壁外层和外壁内层构成，花粉外壁在抵御各种环境、微生物胁迫及授粉时的细胞识别等方面发挥着极其重要的作用。在拟南芥等作物中，已成功克隆了多个与花粉壁形成相关的基因，这些基因突变引起的花粉壁发育缺陷通常造成雄性不育。因此，深入挖掘花粉壁发育的调控机制具有重要意义。本文通过生物信息学、遗传学、分子生物学等手段，详细解析了ZincFinger-Homeodomain（ZHD）家族基因CsZHD4在黄瓜花粉外壁发育中的功能，主要研究结果如下: 1.基于黄瓜全基因组信息共鉴定到13个ZHD家族成员。系统进化分析将它们分为5个分支:ZHDⅠ～Ⅳ和MIF。染色体位置，蛋白的理化性质等分析表明13个CsZHDs虽具有不同的基因结构，但含有相似的ZF和HD保守结构域。共线性分析表明ZHDⅢ、Ⅳ和MIF分支成员可能通过片段重复事件进行了扩增，与水稻相比，黄瓜和拟南芥之间在ZHD基因进化方面有着更密切的关系。 2.CsZHD4在雄花中高度表达。ZHDⅠ分支在黄瓜中唯一的成员CsZHD4（CsaV3_5G027460.1）,含有一个保守的C5H3锌指和一个同源异型结构域，定位于细胞核，是保守的ZHD家族转录因子。进一步qRT-PCR和原位杂交结果验证了CsZHD4在雄花发育第10时期的花药及后期的绒毡层及花粉中高表达。 3.CsZHD4正向调控黄瓜花粉外壁外层的形成。基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，获得了两种不同形式的cszhd4敲除突变体，表型分析发现cszhd4花药发育异常，正反交试验结果表明cszhd4雄性不育。进一步扫描电子显微镜观察及甲苯胺蓝染色分析表明cszhd4的雄性不育由减数分裂后期的花粉败育造成，在其花药内侧观察到大量残留的粘连成簇的败育花粉。TUNEL染色及透射电子显微镜观察结果暗示，cszhd4绒毡层程序性细胞死亡（PCD）紊乱和花粉发育后期无法形成外壁外层是导致花粉败育的原因。 4.CsZHD4可能通过CsCCR和Cs4CL调控花药苯丙烷代谢-木质素单体的合成。UID-mRNAseq分析表明，差异表达基因在参与次级代谢物合成途径和苯丙烷生物合成等相关途径显著富集。ChIP-seq分析预测了CsZHD4的结合DNA基序为TAATTA,UID-mRNAseq与ChIP-seq联合分析结果显示，CsZHD4可以结合559个cszhd4中的差异表达基因，特别是CCR和4CL等多个调控苯丙烷代谢-木质素单体合成的关键基因。酵母单杂交和Dual-LUC试验验证了CsZHD4能够结合并激活CsCCR和Cs4CL的表达。进一步气相色谱-质谱检测到cszhd4花药中G,H木质素单体的含量显著下降。 5.初步验证了csccr和cs4cl敲除突变体具有花粉活性下降的表型。qRT-PCR验证了CsCCR和Cs4CL在cszhd4的表达量显著下调，亚细胞定位证明了它们与CsZHD4共定位在细胞核。基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，分别获得了3种不同基因型的csccr和cs4cl敲除突变体并获得了初步表型，具体机制有待进一步验证。 综上，本文揭示了ZHD家族转录因子CsZHD4在黄瓜花粉发育中的生物学功能。CsZHD4可以通过调控苯丙烷代谢-木质素合成途径中的代谢物在绒毡层中的合成及孢粉素在花粉外壁的沉积进而调控花粉外壁外层的形成。以上研究结果为黄瓜花粉发育和孢粉素在花粉外壁的沉积提供了理论基础。
NETL