摘要
耐药菌的大量出现和广泛传播，给人和动物健康、环境安全带来了严重威胁。为了应对细菌耐药性，不仅需要科学使用抗菌药物，更需要开发新型抗菌化合物以供临床使用。研究人员基于已知化合物训练深度神经网络在DrugRepurposingHub上预测发现了一种对大肠埃希菌等具有体外抗菌活性，且对艰难梭菌等具有体内抗菌活性的化合物SU3327（Halicin）,但并未对SU3327的抗菌谱和抗菌特征进行系统性研究，其具体作用机制也未做进一步阐述，限制了对其是否具有成药性的评估。因此，本研究通过SU3327对常见的动物源病原菌的体外抗菌活性进行测定表征其抗菌谱;通过对大肠埃希菌ATCC25922等代表性菌株杀菌曲线、抗菌后效应和抗菌后亚抑菌浓度效应、耐药性诱导等测定表征其抗菌特征;通过对金黄色葡萄球菌ATCC29213细胞壁、细胞膜和呼吸链的影响深入探究其抗菌机制;并基于其硝基噻唑的结构探究其是否可以对DNA造成损伤，以期将SU3327开发为抗菌药物用于兽医临床。 本研究首先测定了SU3327对13种动物病原菌的体外抗菌活性，结果显示SU3327具有广谱抗菌作用，对葡萄球菌（MIC50∶16μg/mL，MBC50∶64μg/mL）、产气荚膜梭菌（MIC50∶0.5μg/mL,MBC50∶0.5μg/mL）、链球菌（MIC50∶16μg/mL,MBC50∶32μg/mL）等革兰阳性菌和大肠埃希菌（MIC50∶16μg/mL,MBC50∶32μg/mL）、胸膜肺炎放线杆菌（MIC50∶2µg/mL,MBC50∶4μg/mL）、肺炎克雷伯菌（MIC50∶16μg/mL,MBC50∶64μg/mL）等革兰阴性菌和鸡支原体（MIC50∶1μg/mL,MBC50∶1µg/mL）均表现出良好的抗菌效果，优于庆大霉素、氟苯尼考、四环素和复方新诺明等临床常用抗菌药，是一种杀菌型化合物。以大肠埃希菌ATCC25922、金黄色葡萄球菌ATCC29213和胸膜肺炎放线杆菌S6为代表菌分析SU3327抗菌特征，发现SU3327为浓度依赖性，具有较长的抗菌后效应（均大于1h）和抗菌后亚抑菌浓度效应（均大于0.85h），突变选择窗较窄（8-12.8、8-12.8和0.5-1.6μg/mL），不易诱导出细菌耐药性（MIC仅有1倍变化）。动物试验结果显示，SU3327对胸膜肺炎放线杆菌S6引起的小鼠呼吸道感染展现出良好的体内抗菌效果，以25.48mg/kgb.w.、12.74mg/kgb.w.和6.37mg/kgb.w.的剂量灌胃给药或者以3.69mg/kgb.w.、1.47mg/kgb.w.和0.74mg/kgb.w.的剂量腹腔注射，对小鼠血常规、肝功能、肾功能以及各组织脏器表现出较高的安全性，均可显著降低小鼠血液、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的菌载量（减少1.5-3LgCFU/mL或LgCFU/g）,减轻肺部组织炎性细胞浸润。 本研究以金黄色葡萄球菌ATCC29213为代表菌株研究SU3327的作用机制。首先通过生化指标等方法分析其对细菌细胞壁、细胞膜和呼吸链的潜在影响。碱性磷酸酶和细胞膜通透性检测数据显示，SU3327对细胞壁和细胞膜无影响（P＞0.05），而对呼吸链相关的指标如细菌膜电位梯度、pH梯度、胞内ATP等相关研究发现SU3327可破坏细菌质子动力势的跨膜质子梯度，使细菌因能量合成减少而死亡（P＜0.005）。进一步通过SU3327对细菌耗氧量、呼吸链酶活性和NAD+/NADH等指标进行测定，发现其抗菌活性与呼吸链复合物Ⅰ上的电子传递载体甲萘醌类（Menaquinones，MKs）化合物有关，且体外添加MK类化合物可抑制其抗菌活性，体外添加哺乳动物电子传递载体CoQ10则不会引起SU3327MIC的变化，表明哺乳动物电子传递载体对其抗菌活性无影响。通过等温滴定量热法和分子生物学技术证明SU3327可通过与MK结合进而抑制其从复合物Ⅰ到复合物Ⅲ上的电子传递。MIC结果显示，SU3327对MK合成缺陷菌株（MIC∶32µg/mL）的抗菌活性明显降低;当MK合成恢复正常后，SU3327则恢复其原有的抗菌活性（MIC∶8μg/mL）。本研究揭示了SU3327靶向细菌MK发挥抗菌活性的具体机制，同时表明该抗菌机制是细菌所特有的，是具有开发潜力的抗菌靶点。 基于SU3327的硝基噻唑结构，本研究进一步探究其是否可对细菌的DNA造成损伤。SU3327在有氧和无氧条件下对大肠埃希菌ATCC29522（MIC均为8μg/mL,MBC分别为16和8μg/mL）和胸膜肺炎放线杆菌S6（MIC分别为0.5和1μg/mL,MBC均为2μg/mL）均可发挥较强的抗菌活性，且杀菌效率一致;当硝基还原酶的合成被抑制后其抗菌活性变差（MIC提高4倍以上），表明其抗菌活性与细菌中的硝基还原酶有关。通过LC-MS/MS检测大肠埃希菌ATCC25922的胞内外药物浓度，结果显示SU3327可进入细菌胞内，且药物原型随着时间变化逐渐减少;0和60minSU3327处理后胞内代谢物的分析结果显示，其可被细菌胞内硝基还原酶激活后发生氧化还原生成一系列反应性代谢产物，如羟胺类化合物（R-NHOH）和自由基（·OH）。DNA羟甲基化物和DNA损伤标志物等检测结果显示，R-NHOH可与大肠埃希菌ATCC25922、产气荚膜梭菌1P21和胸膜肺炎放线杆菌S6的DNA发生加成反应生成加合物（P＜0.005）,从而引发其单链和双链断裂;而·OH可直接攻击DNA引起其氧化损伤。循环伏安法测定结果显示，SU3327（-364mV）与甲硝唑（-534mV）和呋喃妥因（-380mV）相比较具有更高的氧化还原电位，该特征可能是其与需氧菌中硝基还原酶发生生物活化进而造成其DNA损伤的主要原因。 综上，本研究系统分析了SU3327的抗菌谱和抗菌特征，发现其具有广谱抗菌活性，是一种浓度依赖性的杀菌化合物，具有较长的抗菌后效应和抗菌后亚抑菌浓度效应，且不易诱导细菌产生耐药，并通过小鼠呼吸道感染模型验证了其体内有效性。此外，证实了SU3327是一个多靶点抗菌化合物，不仅靶向细菌电子传递载体影响ATP合成，还可与细菌中的硝基还原酶发生氧化还原反应引起DNA损伤。上述研究结果为SU3327在兽医临床的应用奠定了基础。
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