摘要
伪狂犬病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）是伪狂犬病（PR）的病原体，具有广泛的宿主范围，包括大多数哺乳动物和鸟类，其中猪是其唯一的天然宿主，PR给全球养猪业造成了巨大的经济损失。目前，接种疫苗仍然是防控猪PR的最有效手段，常用的疫苗主要有灭活疫苗、弱毒活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗和重组载体疫苗等。其中，灭活疫苗由于其易制备性和高安全性作为防控PRV的首选。然而，灭活疫苗与基因修饰活疫苗（弱毒活疫苗和病毒载体疫苗）相比，其免疫原性和免疫保护效力通常较低。佐剂作为非特异性免疫增强剂，可以通过增强灭活疫苗的免疫原性、促进抗原递送和呈递、调节免疫反应等方面提高疫苗性能。佐剂的范围可以从小分子化合物到复杂的天然提取物和纳米颗粒材料。然而，对于PRV灭活疫苗，加入单一佐剂并不能达到理想的增强效果。为了提高PRV灭活疫苗的有效性和生物安全性，本文研制出了一种由聚合物稳定的纳米颗粒与水包油乳剂组成的复合纳米佐剂，并对其理化性质、生物安全性和增强PRV灭活疫苗性能等方面进行了系统的研究。主要研究内容和实验结果如下： （1）MIL-53(Al)-水包油乳液复合纳米佐剂的构建及其理化性质研究 首先，本文先通过调控水热法中溶剂的成分，制备了尺寸和形貌均一，平均粒径为160.1nm的铝金属有机框架MIL-53(Al)纳米颗粒，并将聚丙烯酸（PAA）修饰在其表面，获得了生理盐水中稳定的MIL@A纳米颗粒。随后，本文通过探究不同种类的油相、水相、表面活性剂以及改变各成分含量，制备了一种平均粒径为204.6nm的新型水包油乳剂（SW01），并采用MIL@A水溶液作为SW01的水相，制备了MIL@A和SW01的复合物（MIL@A-SW01）。最后，将卡波姆（Carbopol）与MIL@A-SW01混合，构建了稳定的复合纳米佐剂（MIL@A-SW01-C）。本工作不仅成功构建了新型稳定的MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂，也为制备不同形貌大小的MIL-53(Al)纳米颗粒、新型水包油乳剂和复合纳米佐剂提供了参考。 （2）MIL-53(Al)-水包油乳液复合纳米佐剂的生物安全性研究 在前期工作基础上，本工作系统地探究了MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂对不同抗原的负载和缓释能力，以及细胞毒性、血液相容性、生物分布、主要器官组织和注射部位组织等生物学效应，进一步评价其作为疫苗佐剂的潜力。首先，将MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂与不同的抗原混合，采用BCA试剂盒检测其对PRV抗原的负载和缓释能力。结果显示，在抗原浓度为106.0TCID50mL?1时，MIL@A-SW01-C对PRV抗原的负载率大于60%，且使抗原在注射部位缓慢释放，较长时间停留。然后，通过MIL@A-SW01-C的体内外实验来探究了其生物安全性。细胞毒性实验结果显示，即使MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂浓度为0.5mgmL?1，与它共培养的细胞存活率仍大于80%，溶血实验和血常规实验结果显示经MIL@A-SW01-C处理后，所有指标均未超出正常范围值（5%），主要器官和注射部位组织切片结果也显示了其良好的生物安全性。本工作证实了所开发的MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂具有良好的抗原负载能力和体内外生物安全性，为后续猪PRV灭活疫苗的配制以及小鼠和仔猪的免疫保护实验打下了良好基础。 （3）MIL-53(Al)-水包油乳液复合纳米佐剂体内免疫及效果评价研究 本工作中，通过免疫小鼠血清中的特异性抗体水平、脾细胞的增殖、细胞因子的表达水平的测定和攻毒实验，以及免疫仔猪中和抗体效价和猪的攻毒实验对MIL@A-SW01-C的佐剂效果进行了系统探究，并对其可能的机制进行了讨论。首先，分别在第0、14天对小鼠进行两次免疫，首免后第28天取其血清并测定特异性抗体及其亚型水平（IgG1和IgG2a）。结果显示，接种MIL@A-SW01-C佐剂组小鼠的IgG水平和IgG2a/IgG1的比值显著高于市售铝胶和双相201佐剂组，表明该新型复合纳米佐剂配制的疫苗能够引起更强且更均衡的Th1/Th2免疫应答；同时，使用MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂的PRV灭活疫苗可引起更高的脾细胞刺激指数和细胞因子（IFN-γ、IL-2和IL-4）分泌水平，进一步印证了其能够诱导更强更均衡免疫应答的结果；小鼠攻毒结果显示，在两针免疫条件下，MIL@A-SW01-C佐剂组的免疫保护率分别是铝胶和双相201佐剂组的10倍和3倍以上。 为提高接种操作的便捷性，降低接种过程的人力成本和时间成本，本工作进一步探讨了小鼠一针接种的效果。在PRV病毒攻毒实验中，MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂组对小鼠的保护率达86.6%，远高于商用佐剂铝胶（20%）和双相201（33.3%）佐剂。最后，本文对仔猪进行了一针接种及攻毒，观察接种后仔猪的临床表现，并测定中和抗体效价。结果显示，MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂组中和抗体效价最高，攻毒后该组中所有猪没有出现明显的临床症状，保护率为100%，显著高于商用对比佐剂的20%（铝胶佐剂）和60%（双相201佐剂）。 综上所述，本论文成功构建了MIL@A-SW01-C复合纳米佐剂，证实了其生物安全性以及在小鼠和仔猪体内验证了其对PRV灭活疫苗的免疫增强效果，为新型疫苗佐剂研发提供了新的思路。
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