摘要
抑郁症是一种反复发作的慢性精神类疾病，给个人和社会均带来了极重的经济负担。近年来，虽然针对抑郁症病因及病理过程的研究假说已有眉目，但其具体发病机制尚不明确，且许多应用于临床的抗抑郁药具有增加体重、失眠、依赖性强等副作用，因此，寻找与研发具有良好抗抑郁疗效且副作用小的药物迫在眉睫。 作为我国传统文化宝库之一的中草药，在改善情绪、减轻病痛方面具有副作用小的明显优势，且历史悠久，在中医药发达的东亚地区已被使用上千年。其中萱草花，作为萱草科植物，又名忘忧草，早在东汉《本草纲目》中就有记载:“萱草花，性味甘凉，无毒，煮食，治小便赤涩，身体烦热，除酒疸。消食，利湿热，作沮，利胸膈额，安五脏，令人好欢乐，忘忧，轻身明目。”，显示出其抗抑郁特性。现代药理研究显示，芦丁(Rutin)是萱草花的主要活性成分，但关于其发挥抗抑郁疗效的具体靶点和作用机制知之甚少。 因此，本研究采用国际较为公认的抑郁症动物模型——慢性社交挫败应激(Chronicsocialdefeatstress,CSDS)模型，结合分子对接、表面等离子共振成像(Surfaceplasmonresonanceimaging，SPRi)、蛋白免疫印迹(Westernblotting,WB)、定量实时聚合酶链反应(Quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qRT-PCR)、酶联免疫吸附测定(Enzymelinkedimmunosorbentassay，Elisa)、免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation，Co-IP)、染色质免疫共沉淀(Chromatinimmunoprecipitation,ChIP)、原代神经元细胞提取与培养、脑立体定位技术等，于在体和离体两方面深入挖掘芦丁发挥抗抑郁作用的具体靶点和作用机制。 首先，我们利用ChemAxon(ChemAxon,https://www.chemaxon.com/,2017)校正与分析了芦丁的化学机构，并通过分子对接与SPRi技术预测了其对接靶点。结果显示:芦丁与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisomeproliferators-activatedreceptor-γ,PPAR-γ)和NADPH氧化酶4(NADPHoxidase4,NOX4)之间均存在较高的对接得分和相互作用。随后我们对CSDS模型小鼠进行了为期14天的药物治疗，以观察芦丁的潜在抗抑郁效应，结果表明:芦丁显著改善了CSDS小鼠大部分的焦虑及抑郁样行为。但未改善模型小鼠降低的社交意愿及部分焦虑样行为。考虑到中药单体的多重靶点效应，我们推测可能是不同的对接靶点介导了行为背后不同的作用机制。由此，本研究将对PPAR-γ与NOX4两部分分开讨论。 通过核质分离和Co-IP实验我们发现，芦丁显著促进了PPAR-γ的入核及其与核因子κB(Nuclearfactorkappa-B,NF-κB)的结合。考虑到NF-κB介导的炎症通路及神经炎症与抑郁症症状之间的因果关系，本研究进而采用qRT-PCR技术检测了芦丁治疗后小鼠海马脑区诱导型一氧化氮合酶(Induciblenitricoxidesynthase,iNOS),促炎性细胞因子:白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)及抗炎性细胞因子:白介素-10(Interleukin-10,IL-10)的表达，结果显示芦丁可显著缓解CSDS诱导的神经炎症反应。且其治疗效应均受到PPAR-γ特异性拮抗剂GW9662的削弱。随后，我们采用ChIP技术探究芦丁是否通过抑制NF-κB与IL-6、iNOS及TNF-α基因启动子区的结合发挥作用，结果显示:在上述差异表达基因的最佳位置观察到NF-κB富集水平的显著降低。上述实验结果提示芦丁与PPAR-γ结合后，促进其入核及与NF-κB的结合，削弱了NF-κB转录激活功能，从而减少了NF-κB信号通路下游炎症介质的转录。 此外，免疫组化结果显示，CSDS小鼠海马脑区NOX4显著激活。为了进一步细化NOX4的细胞定位，本研究利用免疫组化技术观察神经元标记物(NeuN)、星形胶质细胞标记物(GFAP)及小胶质细胞标记物(Iba-1)与NOX4的共标情况，结果显示NOX4主要表达在神经元上。考虑到NOX4作为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamideadeninedinucleotidephosphate,NADPH)氧化酶家族的成员之一，在调控细胞内氧化还原反应中发挥重要作用，我们采用二氢乙锭(2-Hydroxyethidium,DHE)荧光检测探针，过氧化氢检测法，和Elisa等方法检测动物海马脑区和前额叶皮层的氧化应激指标，结果显示:CSDS模型小鼠海马脑区和前额叶皮层活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)水平及过氧化氢含量显著增加，而过氧化氢酶(Catalase,CAT)、氧化型谷胱甘肽酶(Oxidizedglutathione,GSSG)的活力及表达则有所下降。但可被芦丁治疗扭转。上述实验结果提示芦丁与NOX4的结合降低了小鼠海马脑区和前额叶皮层ROS水平，增强了抗氧化物酶如CAT与GSSG的活力，提高了细胞的抗氧化能力。 综上所述，本研究发现芦丁一方面通过与PPAR-γ结合，促进其入核与NF-κB结合，进而抑制NF-κB介导的神经炎症发挥抗抑郁作用。另一方面通过与NOX4相互作用，调节氧化应激反应，增强细胞抗氧化能力进而发挥抗焦虑抑郁作用。本研究从中药单体的主要活性成分出发，细化至分子与细胞水平，结合在体离体两方面对芦丁发挥抗抑郁作用的具体靶点及机制进行了说明，为抑郁症的发病机制补充了更丰富的实验依据，也为萱草花的临床应用推广及芦丁作为抗抑郁新药的专利申请提供了更坚实的理论基础。
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