摘要
犊牛腹泻在牛养殖过程中十分常见，是造成犊牛生长发育不良和死亡的主要原因之一，给养牛业造成巨大的经济损失。引起犊牛腹泻的原因很多，是细菌、病毒、寄生虫等病原微生物感染及营养缺乏、应激等多种因素共同作用的结果，其中病毒感染是造成犊牛腹泻的重要原因。牛轮状病毒（Bovinerotavirus，BRV）、牛冠状病毒（Bovinecoronavirus，BCoV）和牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）是犊牛腹泻粪便中最常见的三种病毒，随着宏基因组测序的普及，牛星状病毒（Bovineastrovirus，BoAstV）等新型病毒不断在腹泻犊牛中被发现，对BRV、BCoV、BVDV和BoAstV进行分子流行病学调查为犊牛腹泻病原的防控提供有力的理论数据。近些年，BoAstV逐渐成为导致犊牛腹泻的重要病原之一，但人们对BoAstV的遗传进化、致病机制等认识不足，这都给BoAstV的防控提出了严峻考验。因此，对BoAstV进行基因组遗传进化和生物信息学分析、建立BoAstV抗体间接ELISA检测方法对防控犊牛腹泻病、深入解析BoAstV蛋白功能和致病机制、开发抗体检测试剂盒有重要意义。本研究主要包括以下3个方面： 1.我国部分地区犊牛腹泻病原分子流行病学调查。为了解我国致犊牛腹泻病原流行情况，本研究在2020-2022年间采集了我国9个省市牛场的444份犊牛腹泻病料，通过RT-PCR方法，对BRV、BCoV、BVDV和BoAstV进行分子流行病学调查。结果显示，BCoV的阳性检出率最高19.82%，其次是BoAstV、BVDV和BRV，阳性率分别为13.96%、6.08%和5.41%；四种病原存在多种混合感染类型，混合感染率为9.72%；江苏省病原感染情况最复杂，西藏自治区BoAstV的感染率最高达15.44%，河北省BCoV的检出率最高41.17%，浙江省80%样品存在混合感染；乳用型黑白花牛和西门塔尔BCoV感染最多，西藏牦牛BoAstV感染率最高；BoAstV和BVDV夏季检出最多，BCoV冬季高发。通过测序，共获得7条BCoVN基因、2条BVDV1型、1条BRVVP6基因和7条BoAstVORF1b部分序列，分别对序列进行遗传进化分析发现病原存在不同程度的变异，丰富了犊牛腹泻病原的流行病学数据，为犊牛腹泻病的防控奠定坚实的理论基础。 2.BoAstV基因组生物信息学分析。为深入解析BoAstV基因组结构、预测蛋白结构，本实验对一株经高通量测序得到的BoAstV全基因组序列利用ORFFinder、MEGA7.0和Prot-Param等生物信息学分析软件，对基因组的结构、遗传进化、衣壳蛋白分子质量、氨基酸组成、等电点、不稳定系数、亲疏水性质进行分析，并预测关键基因信号肽、跨膜结构域、潜在氨基酸磷酸化位点、B细胞线性抗原表位、关键蛋白二级结构、三级结构和衣壳蛋白保守结构域。结果显示，BoAstV基因组全长为6324bp，属哺乳动物未分类属，与日本毒株BoAstV/JPN/2013关系最近，核苷酸同源性88.4%；预测BoAstV衣壳蛋白分子量为84.38kDa，理论等电点6.16，无跨膜结构域，无信号肽，有潜在磷酸化位点，是稳定亲水性胞内蛋白，包含无规则卷曲（c）、延伸链（e）、α-螺旋（h）和β-转角（t）4种二级结构，三级结构呈心状，存在多个B细胞抗原表位，可作为良好的疫苗备选抗原，为开发相关疫苗和疫病防控提供理论依据。 3.BoAstV间接ELISA抗体检测方法的建立与应用。为了解犊牛群中BoAstV抗体存在情况，本研究选取BoAstV的ORF2全长及5''端保守区域（1-400aa）克隆至原核表达载体pET-28a（+）中，构建重组原核表达载体pET28a-ORF2-2304和pET28a-ORF2-1200。将重组载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中诱导表达并优化诱导条件，经过超声破碎离心并鉴定蛋白可溶性，利用亲和层析镍柱对重组蛋白进行纯化和Westernblot鉴定；利用纯化后的蛋白建立BoAstV间接ELISA检测方法，通过敏感性、稳定性、重复性和特异性等试验验证方法的可行性并对两种方法进行比较，最后检测了80份临床血清样本。结果显示，成功构建了2个重组载体，经条件优化表达，目的蛋白大小分别为108kDa和55kDa左右，均以包涵体形式存在，Westernblot检测目的蛋白免疫原性良好。分别用ORF2-2304和ORF2-1200重组蛋白建立间接ELISA检测方法，并优化反应条件，明确了阴阳性临界值，具有良好的稳定性、重复性、敏感性和特异性，最后ORF2-2304重组蛋白建立的检测方法更佳，初步使用该方法对80份血清进行抗体检测，显示无BoAstV抗体阳性样本，为BoAstV抗体的流行病学调查提供实验数据，并为BoAstV抗体ELISA检测试剂盒的开发奠定理论和实验基础。
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