摘要
牛结节性皮肤病(lumpyskindisease,LSD)是由牛结节性皮肤病病毒(lumpyskindiseasevirus,LSDV)引起的一种牛的全身性、传染性疾病。该病具有高度传染性，感染牛常表现皮肤结节、水疱和溃疡等症状，对养牛业造成了巨大的经济损失。疫苗免疫是防控LSDV感染和传播的主要手段。 本研究首先建立了一种快速检测LSDV的荧光定量PCR检测方法。针对LSDVGPCR(ORF011)基因上保守区域设计引物及探针组合。敏感性测定结果表明，该方法最低检测限度为10copies/μL。特异性研究结果表明，该方法不与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛疱疹病毒(BHV-1)、牛副流感病毒(BPIV)、牛支原体(M.bovis)交叉反应，其具有良好的特异性。对69份临床样品的检测结果表明，该方法与世界动物卫生组织(WOAH)的推荐方法相比具有良好的符合率和稳定性。上述结果表明，本研究成功建立了一种用于检测LSDV的荧光定量PCR检测方法，为后续定量检测LSDV奠定了基础。 本研究拟构建缺失不同基因的LSDV基因缺失病毒。根据LSDV疫苗株与临床毒株间的基因序列差异，靶向可能影响病毒毒力的7个基因:ORF012、ORF034、ORF145、ORF147、ORF148、ORF149和ORF152,利用同源重组方法经过数轮筛选和纯化，最终筛选出ORF012基因缺失株，ORF152基因缺失株和ORF147、ORF148、ORF149的三基因缺失株，分别命名为LSDV△012、LSDV△152和LSDV△147～149。PCR检测结果显示拯救出的缺失型毒株毒种纯净，序列正确且无亲本毒株污染。体外复制能力分析表明，与亲本株相比，基因缺失毒株LSDV△012在MDBK细胞、BHK-21细胞、Vero细胞中复制能力显著降低;基因缺失毒株LSDV△147～149和LSDV△012毒株在A549细胞中复制能力明显降低;在MAC-T细胞中，三株缺失毒株的复制能力较亲本毒株均显著降低。相对于亲本株和LSDV△147～149、LSDV△152而言，干扰素预处理细胞后，显著抑制了LSDV△012的复制。 本研究进一步评价了LSDV及LSDV△012、LSDV△152和LSDV△147～149对小鼠模型的致病能力。试验结果表明，LSDV皮下感染会导致小鼠注射部位出现明显的皮肤结节，但不会导致小鼠的死亡和明显的全身性病变，与LSDV相比，基因缺失毒株对小鼠的致病力显著降低。LSDV△147～149和LSDV△012诱导小鼠产生的LSDV特异性抗体水平明显低于亲本株，然而LSDV△152诱导BALB/c小鼠产生与亲本毒株相似水平的特异性抗体。相比于亲本毒株，LSDV△012和LSDV△152毒株感染后能够诱导更高水平的IFNγ。 综上所述，本研究首先建立了一种基于荧光定量PCR的LSDV检测方法，为病毒的检测和定量奠定了基础。此外，本研究成功构建并筛选出三株不同的基因缺失毒株LSDV△012、LSDV△152和LSDV△147～149,评价了其在不同细胞系中的生长复制能力和对小鼠模型的致病能力以及免疫应答能力，为进一步研制安全有效的LSD疫苗奠定了基础。
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