摘要
组蛋白乙酰化通过将乙酰辅酶A(acetyl-CoA)中的乙酰基团转移至组蛋白尾部的赖氨酸残基，促进染色质解压缩从而激活基因表达。GCN5作为组蛋白乙酰转移酶(HATs)的重要成员之一，负责将乙酰基团添加到组蛋白的特定赖氨酸位点建立乙酰化修饰，在动植物的表观遗传调控及染色质结构调整中发挥着关键作用。然而，GCN5在小麦籽粒发育特别是产量和品质性状形成中发挥的功能和分子机制尚不清楚。实验室前期研究利用CRISPR/Cas9系统获得了TaGCN5基因敲除系材料，本研究在此基础上，通过表型鉴定、蛋白互作、转录组分析、CUT&Tag和ChIP-qPCR等实验方法，重点围绕TaGCN5及其互作蛋白钙调蛋白转录因子TaCAMTA2开展了生物学功能鉴定，并初步解析了TaGCN5-TaCAMTA2调控淀粉和贮藏蛋白(SSPs)积累的分子机制。主要研究结果包括: 1.TaGCN5基因敲除后，与野生型相比，粒宽和千粒重降低，粒长无明显变化，总淀粉含量减少，谷蛋白含量降低，干面筋含量降低，SDS-沉降值降低。对野生型和Tagcn5敲除系授粉后25d胚乳的转录组进行分析发现，Tagcn5敲除系中21个淀粉合成相关基因下调表达。继续利用CUT&Tag和ChIP-qPCR实验，证明TaGCN5直接靶向调控淀粉合成基因和HMW-GS基因启动子区，通过影响组蛋白乙酰化修饰H3K9ac水平来促进其表达。 2.双分子荧光互补(BiFC)、酵母双杂、体外pull-down、免疫共沉淀(Co-IP)四个独立实验证明TaGCN5与钙调蛋白转录因子TaCAMTA2互作。TaCAMTA2在籽粒胚乳中高表达，且在授粉后20-25d的籽粒胚乳中表达最高。原位杂交结果显示，TaCAMTA2在内果皮、外果皮、糊粉层、珠心突起、胚乳中均有表达。利用CRISPR/Cas9系统获得了TaCAMTA2基因敲除系材料，与野生型相比，TaCAMTA2敲除后粒宽、粒长和千粒重降低，总淀粉含量减少，谷蛋白含量没有明显变化。 3.对野生型和Tacamta2敲除系授粉后25d胚乳的转录组进行分析发现，Tacamta2敲除系中有40个淀粉合成相关基因和13个SSPs基因下调表达。通过凝胶迁移实验(EMSA)和转录激活实验，证明TaCAMTA2可以直接结合到淀粉合成相关基因TaSus2和TaSBEIc启动子区CGCG元件并激活淀粉合成基因的表达。对Tagcn5和Tacamta2敲除系的转录组数据进一步的分析显示，有241个基因在Tagcn5和Tacamta2敲除系中同时下调表达，其中包括17个淀粉合成通路基因。利用ChIP-qPCR实验，证明TaCAMTA2还可以通过与TaGCN5互作并招募TaGCN5调控TaSus2和TaSBEIc启动子区H3K9ac水平激活其表达。同时通过EMSA实验证明TaCAMTA2可直接结合TaGlu启动子区CGCG元件调控其表达，但ChIP-qPCR实验表明，Tacamta2中TaGlu启动子区TaGCN5富集程度无明显变化，表明TaGCN5-TaCAMTA2在淀粉和SSPs积累中的调控机制不同。 4.通过对445份小麦种质资源TaCAMTA2等位变异进行分析，我们鉴定到TaCAMTA2-A在小麦自然群体中存在3种单倍型。其中，Hap3对TaSus2具有更强的结合能力，且携带Hap3单倍型的材料籽粒更大，粒重更高，为小麦高产育种提供了可能的新的基因资源。并且开发了分子标记KASP194能够成功区分Hap3和另外两种单倍型，可用于小麦育种中的分子标记辅助选择。
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