摘要
结核病，一种由结核分枝杆菌引发的慢性传染性疾病，迄今为止，它依旧是对人类健康构成重大威胁的首要传染病。自20世纪40年代起，抗生素在结核病治疗中的应用虽取得了一定成效，然而耐药结核病的出现及其在全球范围内广泛流行，已成为目前结核病防治工作中的一项严峻挑战。因此，深入了解结核分枝杆菌对抗生素胁迫的响应机制对于开发新型抗生素和制定结核病精准防治策略至关重要。本研究旨在从两个关键方面探讨结核分枝杆菌对抗生素胁迫的响应策略:首先，我们关注在临床耐药性产生之前，结核分枝杆菌是如何应对药物压力的。通过比较基因组学方法分析临床敏感结核病患者不良治疗结局相关的细菌风险因素，为早期预测患者的临床治疗结局筛选潜在的分子标志物。其次，研究结核分枝杆菌在长期药物压力下的耐药性进化过程。利用进化基因组学方法分析结核分枝杆菌临床菌株耐药性的起源和扩张相关的风险因素,为限制耐药结核病的产生提供理论基础。通过以上两个角度的综合分析，我们不仅能够更全面地理解结核分枝杆菌应对抗生素胁迫的策略，还能为应对日益严峻的抗生素耐药性问题提供科学依据。 1.临床敏感结核分枝杆菌对抗生素的响应策略研究 在一线抗结核治疗方案下，敏感结核病患者的平均治愈率达88％，但由于敏感结核病患者的总体基数较大，全球每年仍然会出现87万例有不良治疗结局的敏感结核病患者。因此，发现与不良治疗结局相关的风险因素对于进一步提高患者治愈率至关重要。以往的研究重点主要聚焦于宿主因素，如患者的依从性、营养状态以及是否有过抗结核治疗经历等，以及环境因素，包括经济状况、教育程度和不良的卫生条件等对结核病治疗效果的影响。结核分枝杆菌的耐药性作为众所周知的影响结核病治疗的细菌因素一直备受关注，但除耐药性外，我们对于其他可能影响结核病治疗的细菌因素的认识仍十分有限。为了深入探讨这一问题，本研究以系统鉴定敏感结核病患者不良治疗结局相关细菌风险因素为目标，一方面评估已报道的可能的细菌风险因素，另一方面基于临床大数据全面筛选潜在的细菌风险因素。 在已报道的可能影响结核病治疗的细菌因素中，本研究聚焦结核分枝杆菌的异质性耐药，即结核病患者体内同时存在耐药菌和敏感菌的现象。首先，我们分析了异质性耐药在结核病患者治疗期间的动态变化及其产生原因。考虑到临床耐药结核病患者体内的异质性耐药（即耐药亚群占比超过1％）更易被常规检测方法所识别，本研究对31例同时对异烟肼和利福平耐药的耐多药结核病(Multidrug-resistanttuberculosis,MDR-TB)患者治疗过程中的83例系列痰培养阳性菌株进行全基因组测序分析(平均测序深度为164×)，发现83.87％的患者在治疗期间出现异质性耐药，持续时间平均为11.11个月(2-36个月)。分析患者体内异质性耐药的动态变化，发现3种现象:1)从完全敏感到异质性耐药，2)从异质性耐药到完全耐药，3)从完全耐药转变为异质性耐药。结合CT影像数据分析，我们发现患者体内的病灶数量与异质性耐药的产生有显著相关性，提示病灶异质性是导致异质性耐药的重要原因。其次，我们仔细评估了异质性耐药对敏感结核病患者治疗结局的影响。由于以往的研究并未对纳入患者进行细致分类(区分耐药与敏感，初治与复治患者)，导致关于异质性耐药与患者不良治疗结局的相关性研究结论不一致。本研究在区分初复治患者的基础上，采用深度全基因组测序技术(平均测序深度为1163×),鉴定并分析了临床敏感结核病患者体内的异质性耐药(即耐药亚群占比不超过1％)对其治疗结局的影响。对45例初治和20例复治的敏感结核病患者治疗前的痰培养阳性菌株的分析结果表明，在45例初治患者的分离菌株中未发现异质性耐药;而在20例复治患者中发现3例存在异质性耐药，但患者已治愈;这表明在当前的联合用药方案下，异质性耐药对敏感结核病患者的治疗效果的影响有限。 为了系统鉴定与敏感结核病患者不良治疗结局相关的细菌因素，我们对来自上海、四川和黑龙江3个研究现场的共计3496例初治敏感结核病患者治疗前的结核分枝杆菌分离株的全基因组测序数据进行分析。参考世界卫生组织(WHO)的标准将测序菌株关联患者的治疗结局分为治疗成功(88.8％，3105/3496)、不良结局(2.6％,91/3496)和其他(8.6％，300/3496)。利用全基因组关联研究(Genome-wideassociationstudies,GWAS)发现14个与不良结局相关的细菌遗传变异。基因组碱基替换类型分析结果表明，有不良结局的患者体内结核分枝杆菌从头积累的氧化损伤的突变特征(C＞T/G＞A)比例更高(26.3％vs22.9％,P=0.027)。风险因素分析结果显示，GWAS鉴定的突变(OR=3.75,95％CI:2.21-6.15)、性别(OR=2.85,95％CI:1.49-6.15)、年龄(1-yearincrease,OR=1.03,95％CI:1.01-1.04)和诊断延迟时间(1-weekincrease,OR=1.02,95％CI:1.01-1.04)均与不良治疗结局独立相关。临床预测模型结果显示，仅基于宿主因素预测患者不良治疗结局的曲线下面积(Areaundercurve，AUC)显著大于仅基于细菌因素的AUC(0.70vs0.58,P＜0.001),而细菌因素和宿主因素相结合会进一步提高模型对敏感结核病患者治疗结局的预测能力(AUC:0.74vs0.70,P=0.010)。 以上结果说明，异质性耐药在耐药结核病患者体内长期普遍存在，患者肺部的多个病灶可能是导致异质性耐药的重要原因;但在敏感结核病患者中，异质性耐药占比较低(耐药亚群占比不超过1％),且与患者的治疗结局无显著相关性。敏感结核分枝杆菌基因组上存在与不良治疗结局相关的遗传变异，但其影响有限，难以单独作为临床预测指标;与细菌因素相比，宿主因素对敏感结核病患者治疗结局的影响更大。 2.临床耐药结核分枝杆菌产生和传播的风险因素研究 耐药结核病根据耐药性的产生方式可分为传播性耐药(原发耐药)和获得性耐药(继发耐药)两类，其中传播性耐药是目前耐药结核病产生的主要原因。面对全球范围内耐药结核病的严峻形势，了解耐药结核分枝杆菌产生和传播相关的风险因素成为了当前耐药结核病防治工作的一个迫切需求。鉴于此，本研究从两个方面深入探讨这一问题:一是系统评估已报道的耐药结核分枝杆菌的体外生长适应性对其传播能力的影响，二是通过进化基因组学方法鉴定新的耐药结核分枝杆菌产生和传播相关的风险因素。 以往的研究表明，与体外生长适应性相关的细菌因素可能影响MDR-TB的传播能力，但由于不同研究中研究区域的不同背景(例如当地菌株的谱系分布、经济状况和结核病负担程度等)可能导致细菌因素与MDR-TB传播的相关性研究结论不一致。本研究旨在通过收集全球已发表的、基于队列研究或人群研究的MDR-TB菌株全基因组测序数据，以菌株的成簇率表征其传播能力，系统评估已报道的与体外生长适应性相关细菌因素对MDR-TB传播的影响。基于纳入的17个国家共计4696株MDR-TB菌株的基因组序列，利用随机效应模型合并不同国家的风险分析结果后发现，补偿性突变(OR=1.07,95％CI:0.72-1.59)、低适应性代价的耐药突变(katGS315T,OR=1.42,95％CI:0.82-2.47;rpoBS450L,OR=1.26,95％CI:0.87-1.83)和菌株的谱系特征(Lineage2,OR=1.50,95％CI:0.95-2.39)并未影响MDR-TB菌株成簇的风险。基于亚组分析结果发现，大多数情况下与体外生长适应性相关的细菌因素与MDR-TB菌株成簇无明显相关性，而低适应性代价的耐药突变katGS315T仅在发展中国家(OR=1.82,95％CI:1.16-2.86)和耐药结核病高负担国家(OR=1.87,95％CI:1.12-3.11)中会增加MDR-TB成簇的风险，强调了经济状况和耐药结核病负担水平等社会环境因素可掩盖细菌适应性相关的遗传因素对MDR-TB传播的影响。 为了刻画我国结核分枝杆菌的耐药性进化过程，本研究从公共数据库中收集并筛选出质控合格的共18118株涵盖中国大陆31个省份的结核分枝杆菌临床分离菌株的全基因组测序数据，构建了较为全面和精细的中国耐药结核分枝杆菌的系统发育结构。分子药敏结果显示，纳入的所有菌株中对任一抗结核药物耐药的菌株占30.7％(5560/18118)，其中MDR-TB菌株占14.4％(2600/18118);基于系统发育结构分析发现，不同抗生素传播性耐药的比例均超过50％，其中吡嗪酰胺比例最高(63.3％，543/858)，MDR-TB菌株中传播性耐药的比例为59.8％(1555/2600);贝叶斯进化分析表明，在所有一线抗结核药物和氟喹诺酮类抗生素中，异烟肼(1952,95％HPD:1912-1983)和链霉素(1952,95％HPD:1913-1984)耐药菌株的产生时间最早，并且所有一线抗结核药物和氟喹诺酮类抗生素耐药性的产生时间与药物引入临床使用的时间呈显著相关性(R=0.93,P=0.007);分析耐药结核分枝杆菌不同耐药突变的积累顺序发现，异烟肼耐药突变绝大多数情况下出现要早于其他抗生素的耐药突变;耐药结核分枝杆菌的群体变化历史分析结果显示，中国耐药结核分枝杆菌经历两次明显历史扩张，分别是抗生素用于抗结核治疗(1950年)和改革开放(1978年)后，2000年以后耐药结核分枝杆菌群体趋于稳定;时间尺度单倍型密度(Time-scaledhaplotypicdensity,THD)分析结果表明，补偿性突变可以显著促进MDR-TB菌株的传播。为了系统鉴定影响耐药结核分枝杆菌产生和传播的细菌因素，本研究分析了全基因组范围内不同遗传突变间的依赖性(Genome-widemutationaldependence)及其产生的先后顺序，结果发现耐药突变产生前，在21个基因上积累的25个突变可能有助于耐药突变的产生;而耐药突变产生后，在15个基因上积累的42个突变可能促进耐药菌的传播。 综上，本研究发现耐药结核分枝杆菌体外生长适应性的增加并不等同于其传播能力的提高，生长适应性相关的细菌因素对耐药结核病传播的影响有限，其作用可能会被社会环境因素所掩盖。耐药结核分枝杆菌的产生和传播过程主要受药物引入临床的时间、人口流动和结核病控制策略等环境因素的影响。此外，细菌因素(如不同药物耐药突变间的相互作用、补偿性进化以及其他特定基因上的遗传变异等)也对耐药结核分枝杆菌的产生和传播产生一定程度的影响。 总之，本论文围绕细菌因素在敏感结核病治疗和耐药结核病产生和传播过程中的作用进行了深入探索，在深入分析导致以往研究结果不一致的潜在原因的基础上，进一步明确指出异质性耐药对敏感结核病患者治疗的影响以及结核分枝杆菌的体外生长适应性对耐多药结核病传播的影响是有限的;本研究首次在全基因组范围内系统鉴定了影响敏感结核病治疗的细菌遗传变异，并结合宿主因素构建了敏感结核病患者治疗结局的临床预测模型，在此基础上，强调了宿主因素对敏感结核病患者的治疗结果的影响更为重要;同时，本研究也构建了目前最大的中国结核分枝杆菌基因组数据集并首次刻画了我国耐药结核分枝杆菌的起源和扩张的进化历程，在全基因组范围内全面筛选了结核分枝杆菌耐药性产生和传播相关的细菌遗传变异，此外，研究还揭示了可能影响耐药结核分枝杆菌产生与传播的社会环境因素。本论文的研究结果不仅拓展了我们对结核分枝杆菌在抗生素压力下适应性进化策略的认识，而且为针对敏感结核病患者制定精准治疗策略以及进一步控制耐药结核病的产生和传播提供了重要的理论基础。
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