摘要
高质量种子是获得高产作物的前提和基础，深入研究种子发育过程的调控机理， 对种子质量提升和作物高产具有重要意义。至今为止，科学家们对玉米籽粒突变体做 了一定的研究，但是仍然有很多未解之谜。本研究以玉米籽粒发育缺陷的突变体为研 究对象，通过图位克隆对其突变基因进行定位，并进一步解析了基因功能，取得的研 究结果如下: 1、籽粒突变体dek616的基因定位及功能分析 dek616是一个田间发现的自然突变体，表现为籽粒变小，百粒重下降，发芽率 降低，幼苗长势迟缓。石蜡切片和半薄切片表明，dek616突变体的胚发育缓慢，BETL 区细胞结构异常。 通过图位克隆定位该基因，最终的定位区间内有一个编码PPR蛋白的基因 ORF8。对编码PPR蛋白的基因进行扩增及测序，发现dek616突变体中该基因的序 列与野生型没有差异，但是在dek616突变体中，该基因的表达量显著下降。从玉米 EMS突变体库中得到一个该基因提前终止的突变体，dek616-ems突变体杂合果穗的 表型与dek616突变体相似。将dek616-ems杂合植株与dek616杂合植株杂交进行 等位验证，其杂交后代中出现了缺陷籽粒的表型，说明ORF8是导致dek616突变 表型的基因。 Dek616基因在玉米的各个组织器官和不同发育时期的籽粒中均有表达，说明该 基因在籽粒的发育及组织器官的生长中均有着重要的作用。对DEK616蛋自序列分 析，发现该蛋白为P型PPR蛋白，亚细胞定位显示DEK616蛋白定位在线粒体中。 对线粒体基因的表达情况进行检测，发现全长的Nad1含量较野生型显著下降,Nad1 的第一个内含子在突变体中剪接异常。Nad1基因第一个内含子的剪接效率明显下降， dek616突变体中Nad1基因转录本的第一个内含子反式剪切异常，第一个外显子和 第二个外显子无法正常拼接，最终导致产生的Nad1成熟转录本的量显著减少。此 外，dek616突变体中线粒体呼吸链复合物Ⅰ的亚基NAD9蛋白含量降低，而复合 物Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的亚基Cytc、COX2、ATPase-B的蛋白积累量增加。在dek616突 变体中，交替氧化酶途径中Aox2和Aox3基因的表达量上升，AOX蛋白的积累量 增加，线粒体结构异常。 2、籽粒突变体smk-wl11的基因定位及功能分析 smk-wl11突变体是前期用B73和转座子Mu活性系杂交后代中筛选到的。突 变体的籽粒发育异常，其成熟种子的大小变小、颜色变浅，突变体籽粒呈现出空瘪的 状态。突变体的粒长、粒宽及粒厚分别减少78.5％、66.1％、42.9％,百粒重仅为野 生型籽粒的11.7％,发芽率仅为7.93％,远低于野生型的98.3％。smk-wl11突变体14 天的幼苗株高变矮，发育缓慢。石蜡切片结果显示，不同发育时期的突变体胚乳均不 能完全充实种子，种皮和胚乳之间存在空腔，胚发育迟缓，盾片结构异常。 前期研究通过BSR-Seq将突变位点定位在一号染色体长臂bin1.07-1.08的位 置，本研究通过图位克隆缩小定位区间，该区间内共有7个蛋白编码基因，其中有 一个编码PPR蛋白的基因ORF7,该基因起始密码子下游456 bp的位置有一个 Mu插入。从Stock Center得到该基因的UniForm Mu突变体smk-wl11-mu,该杂合 突变植株的果穗出现小粒的表型，且与smk-wlH突变体的表型相似。 ORF7基因在玉米器官中组成型表达，在玉米籽粒发育、组织器官形成中发挥重 要作用。ORF7基因只含有一个外显子，编码一个由499个氨基酸构成的P型PPR 蛋白。smk-wl11突变体的线粒体呼吸链复合物Ⅰ亚基NAD9的蛋白含量降低，而 复合物Ⅲ（Cytc亚基）、Ⅳ（COX2亚基）和Ⅴ（ATPase-B亚基）的蛋白积累量 增加。在smk-wl11突变体中，Aox2和Aox3基因的表达量分别增加了 28和16倍 以上，AOX蛋白积累量增多，线粒体结构出现异常。 3、籽粒突变体smk-wl10转录组数据分析 smk-wl10突变体的微管蛋白折叠辅助因子（Tubulin-Folding Cofactor B,TFCB） 表观突变，导致籽粒发育异常。玉米中5个TFCs基因在各个组织和授粉后天数的 种子中均有表达。转录组分析发现了 604个差异表达基因（DEGs）,包括287个上 调基因和317个下调基因，GO分析显著富集到多个生物过程，包括系统发育、胚 胎后发育、生殖发育过程等。
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