摘要
猪丁型冠状病毒(procine Deltacoronaviruses,PDCoV)是一种仅限于肠道增殖 的冠状病毒，感染仔猪后可引起急性萎缩性肠炎，导致脱水、甚至死亡。实验室已有 的蛋白质组学数据显示，PDCoV感染后可以激活猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)内的 PI3K-Akt-mTOR-HIF-1 α信号通路。PI3K-Akt-mTOR信号通路与细胞生命活动密切相 关，可以广泛调节细胞生理过程，其下游的HIF-1α蛋白可以调控病毒复制和促炎细 胞因子的产生。本研究拟在此基础上，应用Western blot技术验证IPEC-J2细胞感染 后其PI3K-Akt-mTOR-HIF-1α信号通路的激活情况，并进一步聚焦HIF-1α蛋白，分 析其对PDCoV的细胞内增殖以及感染细胞内炎症因子转录水平的影响，以期为深入 解析PDCoV的分子致病机制提供新的切入点，也为抗病毒药物的筛选提供新的靶点。 首先，将PDCoV分离株CHN-HN-1601接种IPEC-J2细胞，收集不同时相的细 胞上清，Western blot 分析 PI3K-Akt-mTOR-HIF-1α 信号通路相关蛋白 PI3K、pPI3k、 Akt、pAkt、mTOR、pmTOR和HIF-1α的蛋白水平变化。结果显示，感染后18-24 h (18-24hpi),细胞内 pPI3K/PI3k、pAkt/Akt、pmTOR/mTOR 显著升高;12-24 hpi， HIF-1α蛋白含量明显增加。表明，PDCoV感染后IPEC-J2细胞内的 PI3K-Akt-mTOR-HIF-1α信号通路能够被激活。 其次，构建mRNA-HIF-1α,转染IPEC-J2细胞，确认HIF-1α蛋白表达后接种 PDCoV。利用M蛋白抗体进行Western blot和IFA,观察病毒的增殖变化。结果显示， 12-18 hpi,M蛋白的表达明显减少，与病毒滴度测定结果一致。提示，HIF-1α蛋白 过表达能够抑制PDCoV在细胞中的增殖。进一步，在感染细胞中添加HIF-1α的抑 制剂或siRNA,抑制或干扰细胞内HIF-1α蛋白的表达，接种PDCoV后分析病毒增 殖的变化。Western blot和IFA结果显示，18-24 hpi,病毒M蛋白的表达均显著升高， 与病毒滴度测定结果基本一致。提示，抑制或干扰细胞内HIF-1α蛋白的表达在一定 程度上能够促进PDCoV的增殖。以上结果表明，HIF-1α蛋白在PDCoV的增殖过程 中可能发挥着负调控作用。 为评估HIF-1α蛋白负调控PDCoV增殖可能造成的生物学效应，我们运用 Real-time PCR 技术检测病毒感染后细胞内 IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α、IFN-β 及 TNF-α 的mRNA水平。结果显示，病毒感染IPEC-J2后细胞内IL-6、IFN-α、IFN-β的mRNA 含量明显上调。利用mRNA-HIF-1α过表达细胞内的HIF-1α蛋白，或者添加HIF-1α 抑制剂和siRNA抑制或干扰细胞内HIF-1α蛋白的表达，Real-time PCR检测细胞内 IL-6、IFN-α和IFN-β的mRNA水平。结果显示，18 hpi,HIF-1α蛋白过表达可下调 IL-6的mRNA水平;抑制或干扰HIF-1α蛋白的表达则可上调IL-6的mRNA水平。 以上结果表明，HIF-1α蛋白可以通过调控PDCoV的增殖过程影响细胞内IL-6的转 录。 综上所述，PDCoV感染能够激活IPEC-J2细胞内的PI3K-Akt-mTOR-HIF-1α信 号通路，通路相关蛋白HIF-1α能够对病毒的复制和增殖发挥负调控作用，并进一步 影响细胞内炎症因子IL-6的转录。研究结果为深入解析PDCoV的肠道致病机理提供 了突破口，HIF-1α具有成为抗PDCoV靶标的潜力。
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