摘要
免疫系统是保护人体免受外部感染和内部突变伤害的重要部分，免疫系统防御力强，则不易受到病原体侵袭，与中医理论中的“正气存内，邪不可干”一致。发酵虫草菌粉是代替冬虫夏草的人工产物，具有免疫和抗氧化活性。 目的：通过小分子成分和大分子多糖对发酵虫草菌粉的免疫活性进行研究，结合体外模拟消化探索其胃肠道消化特性；并在现有市场基础上扩展发酵虫草菌粉产品。 方法：1.基于课题组前期对发酵虫草菌粉物质基础研究，将小分子物质导入SwissADME数据库筛选活性成分，结合化源网、PubChem、SwissTargetPrediction得到药物靶点，与GeneCards、DisGeNET、OMIM数据库得到的疾病靶点取交集，进行PPI网络、GO、KEGG分析，并筛选出核心靶点和成分进行分子对接验证。根据网络药理学结果进行发酵虫草菌粉体外模拟胃肠道消化，并建立HPLC检测方法进行含量检测。2.水提醇沉法结合Sevag法提取发酵虫草菌粉粗多糖，采用紫外、红外、扫描电镜、方法检测表征，同时检测还原糖和分子量大小，并对多糖进行体外模拟肠胃道消化，检测消化前后还原糖含量变化和表面结构，用以判断多糖消化特性。将40只雄性KM小鼠分为空白组（K）、低剂量组（D，200mg·kg-1）、中剂量组（Z，400mg·kg-1）、高剂量组（G，800mg·kg-1）四组，空白组给等体积生理盐水，给药组给粗多糖，每天一次，灌胃三周，结束取血清检测IgA、IgM、IgG含量，称重计算脾、肝、肾脏器指数，取出结肠内容物进行16rRNA基因测序并进行功能预测，探讨发酵虫草菌粉粗多糖对正常小鼠肠道菌群的影响。3.取发酵虫草菌粉粗多糖进行泡腾片设计，采用单因素考察崩解剂、填充剂、润滑剂、甜味剂、发酵虫草菌粉多糖，正交试验考察最佳工艺，并对泡腾片进行质量评价。 结果：1.通过网络药理学得到31个活性成分，靶点655个，与疾病去重后的2494个靶点取交集，得到270个靶点，PPI分析结果结合分子对接结果发现腺苷在免疫中发挥着重要作用，同时核苷类成分是发酵虫草菌粉主要有效成分之一，推测腺苷是发酵虫草菌粉在免疫中的主要有效成分，而EGFR、GAPDH、SRC是其主要的靶点，癌症通路（pathwaysincancer）、脂质与动脉硬化信号通路（lipidandatherosclerosis）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路（PI3K/Aktsingalingpathway)、丝裂原活化蛋白激酶信号通路（MAPKsingalingpathway）、细胞凋亡（Apoptosis）等是主要的作用通路。建立了核苷成分胃肠道模拟消化的HPLC检测方法，柱温30℃，流速1.00ml·min-1；检测波长为260nm；进样量为10μL，采用A（水）-B（甲醇）为流动相，梯度洗脱，方法学检测结果显示重现性好，精密度高，准确度高，线性良好。发酵虫草菌粉核苷类成分体外模拟胃肠道消化结果显示核苷类成分在胃部消化初期就已析出，后期消化并未改变含量。2.粗多糖表征检测结果显示发酵虫草菌粉粗多糖纯度为60.11%，此时未检测出还原糖，主要分子量为33492Da和381Da，包含O-H、C-H、C=O、α-(1→6)糖苷键和β-糖苷键，并且含有吡喃糖环。电镜扫描显示其具有不规则的孔洞状结构，经过胃消化后，表面变得较为光滑平整，再次经历肠消化后，表面粗糙，其粗多糖结构已然发生改变。通过对粗多糖胃肠道消化糜液进行还原糖检测，发现粗多糖经历胃部消化后有54.465±0.645%被转化，经历肠道消化后有92.56±2.43%被转化，且转化速率十分迅速。推断发酵虫草菌粉粗多糖经过肠胃道消化后初步能有90%左右的粗多糖被分解。动物实验结果显示粗多糖能提高小鼠肾脏、脾脏和肝脏指数，其中肾脏和肝脏指数的提升更为明显，血清中IgM和IgA含量有显著提升，Alpha多样性分析无显著性差异，Beta多样性显示粗多糖对小鼠肠道菌群丰度有影响，主要改善厚壁菌门与拟杆菌门丰度，并提升菌群中有益菌的丰度。3.得到最佳发酵虫草菌粉多糖泡腾片处方：20%的发酵虫草菌粉粗多糖、1∶1的酸碱比，50%的崩解剂，4%的甜菊糖苷，1%PEG6000，采用蔗糖作为填充剂。 讨论：通过小分子成分和大分子多糖对发酵虫草菌粉免疫活性研究发现，腺苷可能是发酵虫草菌粉小分子免疫中的主要有效成分，并且在胃肠道消化初期便已快速溶出和吸收，从而发挥免疫作用。大分子粗多糖则在胃肠道分别有50%、40%左右被分解，对小鼠的肝肾脏器系数，血清IgM和IgA含量有所提高，并改善肠道菌群从而提高免疫能力。通过单因素和正交实验得到的发酵虫草菌粉粗多糖泡腾片外观光洁平整，崩解溶液口感酸爽，质量可控。从小分子和大分子方向分析发酵虫草菌粉免疫活性，扩展发酵虫草菌粉药物研究的方向和范围，对后期发酵虫草菌粉免疫研究提供一定参考价值，并丰富发酵虫草菌粉多糖制剂的多样性。
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