摘要
目的：中药所含活性成分是其发挥疗效的物质基础。微生物转化中药主要利用微生物酶系的催化作用使中药化学成分发生羟基化、甲基化、脱甲基以及还原、水解等反应，达到提高药效或利用率、降低毒副作用、扩大适应症等目的，具有效率高、选择性强、条件温和等优势。黑曲霉和酵母菌为自然界常见微生物，被广泛应用于食品发酵。枳实为药食两用的江西道地中药材，有关枳实微生物发酵的研究报道极少。因此，本实验主要研究枳实采用酵母菌和黑曲霉分别发酵前后化学成分以及药理作用的变化，并且初步探讨酵母菌在枳实加工中的应用，为微生物转化提升枳实品质及其加工贮藏技术等提供参考。 方法：①利用HPLC检测采用黑曲霉、酵母菌分别发酵前后枳实中的主要成分（芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、橙皮素、川陈皮素、橘红素）的含量，分析发酵前后的成分变化，通过单因素实验结合响应面法考察黑曲霉、酵母菌发酵的影响因素包括时间、加水量、接种量、温度，优化发酵工艺。②利用LC-Q-TOF-MS/MS检测黑曲霉、酵母菌发酵枳实前后的化学成分，并且采用主成分分析和正交偏最小二乘辨别分析比较发酵前后的显著性差异物。③对枳实中的单体成分柚皮苷、川陈皮素进行微生物转化，利用HPLC、色谱技术和NMR分离鉴定相应转化产物。④建立食积动物模型，以小肠推进率、胃内残留率以及胃肠激素MTL、GAS、VIP为指标，测定并比较枳实采用黑曲霉、酵母菌发酵前后对胃肠调节作用的差异。⑤采用三种抗氧化方法（DPPH法、FRAP法、ARTS微板法）测定并比较枳实采用黑曲霉、酵母菌发酵前后的总抗氧化能力的差异。⑥在枳实加工制成饮片的润药过程中接种酵母菌，观察枳实外观性状和内在成分的变化。 结果：①HPLC定量分析发现枳实经黑曲霉、酵母菌分别发酵后，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、橘红素的含量均下降，但是柚皮素、橙皮素的含量增加；黑曲霉发酵枳实的最佳发酵工艺参数为温度35℃，接种量为60%，加水量为100%，时间为6天，在此条件下，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、橘红素的转化率分别为99.32%、97.97%、87.11%、92.54%、32.99%、99.35%，柚皮素、橙皮素的含量分别提高约29.51倍和36.40倍；酵母菌发酵枳实的最佳发酵工艺参数为温度35℃，接种量为15%，加水量为90%，时间为4天，此条件下，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陈皮素、橘红素的转化率分别为73.28%、61.63%、54.30%、51.81%、58.39%、67.74%，柚皮素、橙皮素分别提高了5.65倍和2.94倍。②利用LC-Q-TOF-MS/MS从枳实及黑曲霉、酵母菌发酵物中鉴定了黄酮、生物碱、苯类衍生物、氨基酸及其代谢物等116种化学成分，采用PCA分析发现黑曲霉、酵母菌发酵后与发酵前枳实化学成分轮廓有明显区别，尤其黑曲霉发酵后，与发酵前枳实组的距离最远即成分变化更为显著。采用OPLS-DA分析发现，黑曲霉发酵后，枳实中发生明显变化成分主要包括黄酮、生物碱、苯类衍生物、氨基酸和核苷酸及其代谢物、有机酸及其衍生物等，其中，绝大多数黄酮苷元尤其苯环上有羟基取代并且甲氧基取代数目较少的黄酮在发酵后含量增加，不含糖基的苯类衍生物以及生物碱的含量增加，然而相应糖苷类成分的含量明显下降甚至消失；经酵母菌发酵后，枳实中的黄酮、苯类衍生物等产生明显变化，与黑曲酶发酵相比，发生变化的成分数量相对减少。③HPLC证实柚皮素为柚皮苷经黑曲霉发酵后的产物之一；川陈皮素经黑曲霉发酵后得到5,6,7,8,3''-五甲氧基-4'',5''-二羟基黄酮。④与模型组比较，酵母菌发酵后可恢复食积小鼠的进食量，显著降低胃内残留率(P＜0.01)和显著升高小肠推进率(P＜0.01)。增加食积小鼠胃肠激素MTL、GAS水平，降低VIP水平;黑曲霉发酵后，显著增加胃内残留率(P＜0.05)和显著降低小肠推进率(P＜0.01)，降低食积小鼠胃肠激素MTL、GAS水平，增加VIP水平。⑤DPPH、FRAP及ARTS微板法比较枳实经黑曲霉和酵母菌发酵前后的总抗氧化能力，三种方法的结果一致，黑曲霉、酵母菌发酵后枳实的抗氧化能力都明显增强。⑥将酵母菌引入枳实切片的润药过程中，不仅可以转化其中的化学成分，还可以显著抑制枳实药材霉变。 结论：黑曲霉和酵母菌发酵均可以使枳实中的黄酮、苯类衍生物等多种成分发生转化。黑曲霉主要发挥脱糖基、去甲基及羟基化作用。经黑曲霉和酵母菌发酵后，枳实的抗氧化活性均增强，但是对胃肠的调节作用却相反，其中，黑曲霉发酵后枳实的胃肠促进能力减弱，酵母菌发酵后枳实的促进胃肠运动能力增强。本实验还优化了枳实黑曲酶和酵母菌发酵的转化条件，尝试将酵母菌应用于枳实药材的加工例如润制过程不仅提高药效，还可以抑制霉变。以上研究结果可为微生物转化柑橘属植物来源药材的相关研究与应用提供参考。
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