摘要
枇杷（EriobotryajaponicaLindl.）是蔷薇科枇杷属双子叶植物，作为一种传统的药食两用植物，具有较高的利用价值。在枇杷生长过程中，会有大量未得到合理应用的枇杷叶和枇杷花，造成资源的浪费。如能物尽其用，变废为宝，对环境及资源利用有着深远的意义。 为了扩大枇杷叶和枇杷花的资源利用，本课题开展了不同生长期枇杷叶（嫩叶、黄叶、老叶和落叶）、枇杷花（未开、待开、初放和盛开）及不同采收期枇杷叶（2、4、6、8、10和12月）的物质基础研究；进一步采用辣椒素联合氨水刺激诱导的慢性咳嗽小鼠模型和卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的哮喘小鼠模型开展枇杷叶、枇杷花及枇杷润肺汤（Pi-Pa-Run-Fei-Tang，PPRFT）（以枇杷叶为君药的省名中医经验方）的药效研究；并从抗炎、氧化应激、免疫失衡、辅助性T细胞17（Thelpercell17,Th17）/调节性T细胞（RegulatoryTcell,Treg）失衡等方面对枇杷叶、枇杷花及PPRFT止咳平喘作用机制进行了初步探讨。 本论文主要研究内容与结果如下： （1）基于超高效液相色谱飞行时间质谱（Ultraperformanceliquidchromatographytimeofflightmassspectrometer,UPLC/Q-TOF-MS/MS）技术，对不同生长期枇杷叶、枇杷花及不同采收期枇杷叶水提液的化学成分进行了分析和表征，共鉴定120种化学成分。并通过自由基清除能力、还原能力、抗脂质过氧化能力、Cu2+螯合能力及抗氧化酶活性等实验对其抗氧化能力进行了考察，并进行了抗氧化谱效关联性分析，结果表明不同生长期枇杷叶、枇杷花及不同采收期枇杷叶都有较好的抗氧化效果，D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖、柠檬酸、棒曲霉素、5-甲氧基水杨酸、绿原酸、苯甲酸、亚麻子酸、(-)-表儿茶素、亚油酸、槲皮素、马钱子酸、山奈酚、棕榈酸乙酯、棕榈酸、胍酸、L-谷氨酰胺、金丝桃苷、木犀草素与抗氧化活性显著相关，D-半乳糖、棕榈酸乙酯、L-谷氨酰胺和金丝桃苷与抗氧化指标表达量显著相关。 （2）通过网络药理学和分子对接技术阐明枇杷发挥止咳平喘作用的可能活性成分、相关靶点和机制通路。结果表明，异鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、槲皮素和(-)-表儿茶素等成分是枇杷止咳平喘的关键活性成分。蛋白激酶B（ProteinkinaseB,AKT）、白介素10（Interleukin-10,IL-10）、肿瘤坏死因子α（Tumornecrosisfactor-α,TNF-α）、白介素6（Interleukin-6,IL-6）、络氨酸激酶2（Januskinase2,JAK2）、信号传导和转录激活因子（Signaltransducerandactivatoroftranscription3,STAT3）、核因子-κB（Nuclearfactorkappa-κB,NF-κB）、白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）、白介素17（Interleukin-17,IL-17）、膦酸酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）等靶点可能是枇杷止咳平喘的关键靶点，主要涉及氧化应激、Th17/Treg平衡、络氨酸激酶2（Januskinase2,JAK2）/信号传导和转录激活因子（Signaltransducerandactivatoroftranscription3,STAT3）及膦酸酰肌醇-3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/AKT相关通路。 （3）以12月份枇杷老叶和盛开枇杷花为原料，利用慢性咳嗽小鼠模型和哮喘小鼠模型分别探讨枇杷叶、枇杷花水提液止咳平喘的药效。在慢性咳嗽小鼠模型中，枇杷叶、枇杷花水提液显著性减少小鼠咳嗽次数，延长咳嗽潜伏期；缓解小鼠脾脏Th17/Treg失衡；显著性下调血清IL-6、IL-1β、IL-17和TNF-α和上调IL-10水平；缓解肺组织损伤、黏液分泌和胶原沉积。在哮喘小鼠模型中，枇杷叶、枇杷花的水提液显著性降低哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolarlavagefluid,BALF）白细胞总数、中性粒细胞比例、嗜酸性粒细胞比例，下调BALFIL-6、IL-1β、TNF-α水平，下调血清IL-17、免疫球蛋白E（Immunoglobulin,Ig-E）水平，上调血清IL-10水平；缓解哮喘小鼠脾脏Th17/Treg失衡；上调肺组织超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase,GSH-Px）和下调促红细胞生成素（Erythropoietin,EPO）、一氧化氮（NitricOxide,NO）、丙二醛（Malonicdialdehyde,MDA）水平；改善哮喘小鼠肺组织损伤、黏液分泌、胶原沉积。表明枇杷叶、枇杷花水提液对慢性咳嗽小鼠和哮喘小鼠具有较好的治疗作用。 （4）结合枇杷叶、枇杷花止咳平喘的药效结果，应用代谢组学探讨枇杷叶、枇杷花水提液对慢性咳嗽小鼠和哮喘小鼠血清代谢的调节作用，结果显示枇杷叶、枇杷花的水提液显著性调节慢性咳嗽小鼠血清中45种差异代谢物，涉及39条代谢通路，显著性影响哮喘小鼠血清中35种差异代谢物，涉及31条代谢通路。 （5）采用实时荧光定量PCR（Quantitativereal-timePCR,qPCR）、免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）及免疫印迹（Westernblot,WB）技术检测了PI3K/AKT/NF-ΚB和IL-6/JAK2/STAT3/IL-17信号通路相关基因和蛋白的表达水平来探究枇杷叶、枇杷花水提液止咳平喘的作用机制。枇杷叶、枇杷花水提液显著性降低慢性咳嗽小鼠和哮喘小鼠肺组织IL-17、视黄醇相关孤儿受体（Retinoid-relatedorphanreceptor,RORT）的信使核糖核酸（messengerRNA,mRNA）及蛋白表达，升高IL-10、叉头框蛋白P3（ForkheadboxP3,FOXP3）的mRNA及蛋白表达，从而缓解Th17/Treg失衡；此外，枇杷叶、枇杷花水提液显著性降低了PI3K、AKT、NF-ΚB、IL-6、JAK2、STAT3的mRNA表达及磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶（Phosphorylationofphosphatidylinositol3-kinase,p-PI3K）/PI3K、磷酸化蛋白激酶B（PhosphorylationofproteinkinaseB,p-AKT）/AKT、NF-ΚB、IL-6、磷酸化络氨酸激酶2（PhosphorylationofJanuskinase2,p-JAK2）/JAK2、磷酸化信号传导和转录激活因子3（Phosphorylationofsignaltransducerandactivatoroftranscription3,p-STAT3）/STAT3的蛋白表达水平，表明枇杷叶、枇杷花水提液可能通过抑制PI3K/AKT/NF-ΚB和IL-6/JAK2/STAT3/IL-17信号通路发挥止咳平喘的作用。 （6）基于枇杷叶和枇杷花化学成分和功效评价的基础上，对以枇杷叶为君药的省名中医经验方PPRFT水提液进行止咳平喘药效评价及机制研究。通过UPLC/Q-TOF-MS/MS技术对PPRFT物质成分进行鉴定；进一步评价PPRFT止咳平喘的药效；并通过非靶向血清代谢组学考察PPRFT对慢性咳嗽小鼠及哮喘小鼠的调节作用和qPCR、IHC和WB技术探讨PPRFT发挥止咳平喘药效的可能机制。结果表明PPRFT中共鉴定出112种化学成分，PPRFT可能通过抑制炎症反应和缓解Th17/Treg失衡来达到治疗慢性咳嗽和哮喘的作用，PPRFT治疗慢性咳嗽的代谢机制可能与糖酵解/葡萄糖生成代谢、氨基酸生物合成和丙酮酸代谢有关，治疗哮喘的代谢机制可能与半乳糖代谢、三羧酸（Tricarboxylicacid,TCA）循环以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢有关。此外，PPRFT显著性下调了IL-17、RORT、NF-ΚB、IL-6的mRNA和蛋白表达，显著性上调了IL-10和FOXP3mRNA和蛋白表达，抑制了PI3K、AKT、JAK2、STAT3的mRNA表达及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的蛋白表达水平，表明PPRFT治疗慢性咳嗽和哮喘的途径可能与IL-6/JAK2/STAT3/IL-17和PI3K/AKT/NF-ΚB机制有关。 综上所述，本研究阐明了不同生长期枇杷叶、枇杷花及不同采收期枇杷叶水提液的物质基础，结合网络药理学、分子对接研究了枇杷止咳平喘可能靶点和机制通路，在此基础上运用多学科技术探讨了枇杷叶、枇杷花和PPRFT止咳平喘的药效及机制。结果表明，枇杷叶、枇杷花及PPRFT都具有较好的止咳平喘作用，且PPRFT治疗效果优于枇杷叶和枇杷花。枇杷叶、枇杷花和PPRFT可能通过抑制PI3K/AKT/NF-ΚB和IL-6/JAK2/STAT3/IL-17信号通路、缓解Th17/Treg失衡和氧化应激发挥止咳平喘药效。
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