摘要
目的： 人参皂苷Rg5具有良好的抗癌作用，已被证实能够抑制多种癌症的发展，然而，人参皂苷Rg5针对结肠癌的研究尚未见报道。本课题采用HT-29、SW480和RKO三株结肠癌细胞为研究对象，探索人参皂苷Rg5在体内外水平对结肠癌增殖、迁移与侵袭的影响，明确人参皂苷Rg5治疗结肠癌的分子机制，为深入了解人参皂苷Rg5抗癌作用和分子机制提供参考，为进一步开发人参皂苷Rg5药物提供实验基础和理论依据。 方法： 1.人参皂苷Rg5在体外水平对结肠癌的影响 采用HT-29、SW480和RKO三株结肠癌细胞为研究对象，实验分为空白对照、溶剂对照和药物治疗组。①MTT法检测0、40、80、160和320μmol人参皂苷Rg5对HT-29、SW480和RKO细胞增殖的影响；②PI染色检测人参皂苷Rg5对HT-29、SW480和RKO细胞周期的影响；③AnnexinⅤ-FITC/PI检测人参皂苷Rg5对HT-29、SW480和RKO细胞凋亡的影响；④克隆形成实验检测人参皂苷Rg5对HT-29、SW480和RKO细胞体外成瘤能力的影响；⑤细胞划痕和Transwell实验检测人参皂苷Rg5对HT-29、SW480和RKO细胞迁移与侵袭力的影响。 2.人参皂苷Rg5在体内水平对结肠癌移植瘤的影响 将对数生长期的HT-29细胞接种到裸鼠右侧腋下，当肿瘤体积达到60mm3时，将裸鼠分为三组（对照组、低浓度组和高浓度组，每组5只），使每组肿瘤的平均体积大致相同，采用腹腔注射方式给药，持续21天。 观察、测量并记录肿瘤体积和裸鼠体重的变化，绘制肿瘤生长和裸鼠体重变化曲线，检测人参皂苷Rg5对裸鼠移植瘤生长的影响。HE染色和免疫组化检测人参皂苷Rg5对裸鼠移植瘤瘤体的病理学形态和增殖情况。 3.人参皂苷Rg5抑制结肠癌的分子靶点预测 网络药理学、分子对接和SPR分子互作技术预测人参皂苷Rg5抑制结肠癌的分子靶点。 ①利用SwissTargetPrediction、SEA和PharmMapper数据库筛选人参皂苷Rg5的有效靶点；Genecard和OMIM数据库筛选结肠癌的作用靶点，取二者交集靶点构建蛋白互作网络和富集分析，筛选人参皂苷Rg5抑制结肠癌的作用靶点和相关信号通路；②分子对接分析人参皂苷Rg5与预测靶点的对接情况，结合网络药理学分析显示，EGFR蛋白与人参皂苷Rg5具有良好的结合力；③SPR分子互作技术分析人参皂苷Rg5与EGFR的亲和力，对分子对接结果进行验证。 4.人参皂苷Rg5抑制结肠癌的分子机制验证 ①WesternBlot检测EGFR、JAK1与STAT3基因及其磷酸化基因在结肠癌HT-29、SW480和RKO细胞中的表达水平；②WesternBlot检测人参皂苷Rg5对结肠癌细胞周期蛋白（p53、p21、CyclinD1）、细胞凋亡基因（BAX、BCL-2、BCL-XL）以及细胞迁移与侵袭相关蛋白（MMP2、MMP9）的表达水平的影响；③WesternBlot检测经人参皂苷Rg5处理的HT-29细胞中EGFR、JAK1与STAT3基因及其磷酸化基因表达水平的影响。 结果： 1.体外实验结果 ①人参皂苷Rg5可以显著抑制结HT-29、SW480和RKO细胞的增殖（p＜0.01），且具有时间和剂量依赖性；②PI染色检测显示人参皂苷Rg5诱导HT-29、SW480和RKO细胞周期阻滞在G0/G1期，差异具有统计学意义（p＜0.01）。③AnnexinV-FITC检测结果显示，人参皂苷Rg5可以诱导HT-29、SW480和RKO细胞凋亡，且随着浓度的增加效果更加明显（p＜0.01）。④克隆形成实验结果显示，相比于对照组，人参皂苷Rg5可以显著抑制HT-29、SW480和RKO细胞的体外成瘤能力（p＜0.01）；⑤细胞划痕实验显示，人参皂苷Rg5处理后，HT-29、SW480和RKO细胞的迁移能力受到显著的抑制（p＜0.01）；⑥Transwell实验结果显示，人参皂苷Rg5对HT-29和SW480细胞的侵袭力具有显著的抑制作用（p＜0.01）。以上实验结果说明：①人参皂苷Rg5通过阻滞结肠癌细胞周期在G0/G1期和诱导细胞凋亡抑制结肠癌细胞的增殖；②人参皂苷Rg5可以抑制结肠癌细胞的迁移与侵袭。 2.体内实验结果 ①体内实验结果显示，人参皂苷Rg5可以显著抑制结肠癌移植瘤在体内的生长（p＜0.01），裸鼠体重没有明显的变化（p＞0.05）。②HE染色和免疫组化结果显示，人参皂苷Rg5处理组Ki67的阳性率明显降低（p＜0.01），表明了人参皂苷Rg5可以在体内抑制结肠癌的增殖。 3.网络药理学、分子对接和SPR分子互作技术分析结果 ①网络药理学分析获得25个交集靶点，利用交集靶点进行蛋白质互作网络分析获得10个核心靶点，分别是EGFR、MMP9、STAT3、MMP2、HSP90AA1、MAPK8、mTOR、MAKP14、IL-2和NOTCH1，信号通路富集分析显示人参皂苷Rg5是通过EGFR/JAK/STAT调控结肠癌的进程；②分子对接结果显示，人参皂苷Rg5与EGFR胞内外蛋白均具有良好的结合力；③SPR分子互作技术显示，人参皂苷Rg5与EGFR胞内外蛋白都存在着很强的亲和力，EGFR-HEK293（EGFR胞外蛋白）的亲和力为22.17KD，与EGFR-SF9（EGFR胞内蛋白）的亲和力为20.8KD。 4.人参皂苷Rg5抑制结肠癌分子机制验证 ①WesternBlot结果显示，HT-29和RKO细胞中EGFR与p-EGFR的表达量显著高于SW480细胞，HT-29细胞JAK1和STAT3及其磷酸化蛋白的表达显著高于RKO细胞（p＜0.01）；②人参皂苷Rg5处理后HT-29细胞中p53、p21、BAX的表达水平明显增加，CyclinD1、BCL-2、BCL-XL、MMP2、MMP9的表达水平显著降低；③人参皂苷Rg5处理后HT-29细胞中p-EGFR（Tyr1173）、p-JAK1（Tyr1022/1023）和p-STAT3（Tyr705）的表达显著降低，差异具有统计学意义。 结论： 1.在体外水平，人参皂苷Rg5可以显著抑制结肠癌HT-29、RKO和SW480细胞的增殖，且随着Rg5浓度的增加效果越明显，具有时间和剂量依赖性； 2.人参皂苷Rg5可以显著抑制结肠癌在体内的生长，是一种低毒且有效的治疗结肠癌的新型药物； 3.EGFR蛋白是人参皂苷Rg5的分子靶标，人参皂苷Rg5是通过调节EGFR/JAK/STAT信号通路抑制结肠癌的发生与发展； 4.人参皂苷Rg5是通过调节EGFR/JAK1/STAT3信号通路抑制结肠癌的增殖、转移与侵袭。
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