摘要
目的： 通过观察不同比例麻黄、五味子配伍对哮喘模型大鼠的影响，探究其治疗效果与作用机制，阐释麻黄-五味子“辛散酸收”的配伍原理。 方法： 1.通过检索“中国中医药数据库检索系统”，筛选出包含麻黄-五味子配伍使用的方剂，梳理麻黄-五味子配伍使用源流，统计麻黄-五味子治疗疾病种类及用量比例，选取麻黄-五味子用量比例频次前三位，作为动物实验用药比例依据； 2.通过中药系统药理学数据库与分析平台获得麻黄-五味子作用潜在靶点，利用DrugBank、GeneCards和OMIM数据库获取哮喘疾病靶点，筛选出药物与疾病共同靶点，构建蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Proteininteraction,PPI）网络，使用Metascape平台预测生物过程、细胞成分，交叉靶标所涉及的分子功能和信号传导途径，结合文献研究筛选出麻黄-五味子防治哮喘的潜在作用靶点。 3.使用SPF级雄性大鼠，适应性喂养一周后，按体重随机分为10组，分别为正常组、模型组、麻黄-五味子1∶1组、麻黄-五味子3∶2组、麻黄-五味子2∶1组、麻黄6g组、麻黄9g组、麻黄12g组、五味子6g组和阳性药（异丙托溴铵）组，每组10只。除正常组外，所有大鼠于第0、7天注射卵蛋白和氢氧化铝致敏液，于第14天开始，使用2%卵蛋白雾化激发，每天30min，持续21d。造模完成后，给药组大鼠给予相应药物治疗，持续14d，给药结束后，大鼠麻醉状态下取材。采用HE、Masson染色法检测大鼠肺部病理改变，免疫组化法检测各组大鼠气道α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin，α-SMA）表达，酶联免疫吸附法检测大鼠肺组织白介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）表达水平，蛋白免疫印迹法检测磷酸酯酶C（PhospholipaseC,PLC）、瞬时受体电位通道1(Transientreceptorpotentialchannel1,TRPC1)、肌球蛋白轻链激酶（Myosinlightchainkinase,MLCK）、核因子-κB（Nuclearfactor-kappaB,NF-κB）蛋白表达水平，实时荧光定量PCR法检测PLC-β1、TRPC1、MLCK、NF-κBmRNA表达水平。 4.使用液相色谱-质谱分析（Liquidchromatographytandemmassspectrometry,LC-MS/MS）法，检测麻黄-五味子汤剂中主要成分。 结果： 1.文献研究：麻黄与五味子配伍始于汉唐时期，发展于宋金元时期，完善于明清时期，主要运用于“上气”、“气喘”、“哮病”等肺系疾病，用药比例前三位分别为1∶1、3∶2、2∶1。 2.网络药理学研究：麻黄有22个活性成分，五味子有8个活性成分，二者共有225个潜在作用靶点。筛选出1159个与哮喘相关的靶点，115个药物疾病交叉靶点，包括IL-6、TNF、TP53、IL-1β等核心靶点，涉及钙离子通道、PI3K/AKT、NF-κB等信号通路。 3.实验研究： 3.1一般情况：正常组大鼠精神状态好，模型组大鼠体重增长减缓，出现咳嗽、喷嚏、气喘、喉间痰鸣音等哮喘典型症状，经不同比例麻黄-五味子治疗后，其症状得到一定程度改善，且效果优于单味药组。 3.2HE、Masson染色：正常组大鼠气道无明显病理改变。与正常组相比，模型组大鼠气道炎症浸润、胶原蛋白纤维沉积显著加重（P＜0.01），经给药治疗后均有一定程度改善。通过病理评分发现，麻黄-五味子3∶2、2∶1组和阳性药组对哮喘大鼠气道炎症水平有明显改善作用（P＜0.01），麻黄-五味子1∶1组气道炎症水平减轻（P＜0.05），各治疗组均能减轻哮喘大鼠气道周围胶原蛋白纤维沉积。 3.3免疫组化：与正常组相比，模型组大鼠气道α-SMA表达显著升高。与模型组相比，麻黄-五味子3∶2组、麻黄12g组、五味子6g组、阳性药组显著降低α-SMA表达（P＜0.01），其余治疗组均能降低α-SMA表达（P＜0.05）。 3.4ELISA：与正常组相比，模型组大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平显著上调（P＜0.01）。与模型组相比，麻黄-五味子1∶1组和阳性药组显著降低TNF-α表达（P＜0.01），麻黄-五味子3∶2、2∶1组和五味子6g组降低TNF-α表达（P＜0.05），其余各组均能降低TNF-α表达，但无统计学意义。IL-1β在各治疗组中均显著降低（P＜0.01）。麻黄-五味子不同比例组和阳性药组均显著降低IL-6表达（P＜0.01）。 3.5WB：与正常组相比，模型组大鼠PLC、MLCK、NF-κB蛋白显著升高(P＜0.01)，TRPC1蛋白表达升高(P＜0.05)。与模型组相比，麻黄-五味1∶1、3∶2组和五味子6g组大鼠肺组织PLC蛋白表达显著下降(P＜0.01)，2∶1组，五味子6g组PLC蛋白含量降低(P＜0.05)。1∶1、3∶2组和五味子6g组TRPC1蛋白显著下降(P＜0.01)，阳性药组TRPC1蛋白降低(P＜0.05)。麻黄-五味子3∶2、2∶1组、麻黄6g组和阳性药组均能显著降低MLCK蛋白含量(P＜0.01)。各治疗组大鼠肺组织NF-κBP65蛋白表达均降低，其中麻黄-五味子3∶2、2∶1组、麻黄6g组、麻黄12g组、五味子6g组和阳性药组均能显著降低NF-κBP65蛋白表达(P＜0.01)。 3.6PCR：与正常组相比，模型组PLC-β1、TRPC1、MLCK、NF-κBP65mRNA表达显著升高(P＜0.01)；与模型组相比，麻黄-五味子3∶2组，麻黄-五味子2∶1组，麻黄6g组，阳性药组均能显著降低PLC-β1mRNA表达(P＜0.01)，麻黄-五味子1∶1组能够降低PLC-β1mRNA表达(P＜0.05)。TRPC1mRNA在麻黄-五味子1∶1组、麻黄-五味子3∶2组和阳性药组大鼠肺组织中显著降低(P＜0.01)，麻黄-五味子2∶1组降低TRPC1mRNA表达(P＜0.05)。与模型组相比，麻黄-五味子1∶1组、3∶2组、2∶1组、麻黄12g组和阳性药组均能显著降低哮喘大鼠肺组织MLCKmRNA表达(P＜0.01)。麻黄-五味子1∶1组、3∶2组、麻黄9g组、麻黄12g组和阳性药组均能降低哮喘大鼠NF-κBP65mRNA表达(P＜0.01或P＜0.05)。 4.LC-MS/MS检测：3个批次麻黄-五味子水煎液中，共含有5552个成分，其中正离子模式检测出3865个成分，负离子模式检测出1687个成分，通过相对含量排序，发现其主要成分为麻黄碱、5,6,7三甲氧基黄酮、毛喉素、4-甲基苯基丙酮等物质，将所有成分聚类分析，发现麻黄-五味子水煎液主要成分I级分类主要为氨基酸及其衍生物、生物碱和有机酸等。 结论： 1.麻黄-五味子对哮喘大鼠具有治疗作用，二者配伍能够产生协同作用，疗效优于单味药使用。在改善病理损伤，调控PLC、TRPC1、MLCK、NF-κBP65mRNA表达时，麻黄-五味子使用比例为3∶2疗效更佳。 2.麻黄-五味子抑制PLC/TRPC1信号通路，降低下游MLCK、NF-κB、α-SAM表达，减少TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子水平，缓解哮喘大鼠气道高反应性、气道炎症与气道重塑，其主要有效成分可能为麻黄碱、5,6,7三甲氧基黄酮和毛喉素。 3.如将舒张气道平滑肌类比为“辛散”，抑制气道平滑肌增殖类比“酸收”，上述结果或是麻黄-五味子“辛散酸收”配伍原理之一。
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