摘要
【目的】甜瓜（CucumismeloL.）是世界范围内广泛栽培的园艺经济作物之一。哈密瓜是新疆的特色优势作物，属于厚皮甜瓜栽培类型。近年来，随着设施环境的改善及栽培技术的进步，哈密瓜已在我国保护地广泛栽培。然而，由于哈密瓜设施栽培中受弱光、CO2亏缺等不利环境因素的影响，普遍存在产量和品质下降的问题。植物叶色突变体不仅可以作为标记性状用于杂交种子纯度的鉴定，还是植物光合作用、光形态建成、叶绿体结构与功能、遗传发育调控等基础研究的理想材料。目前关于甜瓜叶色突变体的研究较少，其生理及分子机制尚不明确。因此，利用哈密瓜叶色突变体资源，解析突变体叶绿素代谢、叶绿体结构发育和光合作用变化的调控机制，对于哈密瓜高光效调控基因的挖掘及品种遗传改良具有重要意义。 【方法】本研究以稳定遗传的哈密瓜黄绿叶自然突变体Cmygl-1（MT）和野生型（WT）株系为试验材料。（1）分别对植株光合色素含量、叶绿体结构、活性氧物质（ROS）含量及抗氧化酶活性、光合及叶绿素荧光特性、光合关键酶活性等生理生化指标进行检测，比较分析MT光合生理特性的变化；（2）通过转录和代谢组关联分析及MT响应不同光照强度的蛋白质组分析，解析MT叶色变异的分子机制；（3）构建MT与WT的F2遗传分离群体，分析突变表型的遗传规律，并采用混池重测序关联分析（BSA-seq）初步定位突变候选基因，然后通过候选基因的qRT-PCR表达分析、亚细胞定位及VIGS沉默表达，验证候选基因的功能。 【结果】本研究的主要结果如下： （1）明确了哈密瓜黄绿叶突变体Cmygl-1叶色黄绿表型受单隐性核等位基因调控；MT叶绿体结构受损，叶绿素含量显著降低导致类胡萝卜素比例升高，使叶片呈现黄绿色；PSII反应中心活性降低，光合电子传递受阻导致MT中积累了大量的ROS，并诱导了抗氧化系统酶活性的升高；MT的光补偿点和饱和点显著降低，强光下更易发生光抑制；MT具有较低的CO2补偿点，C4光合关键酶活性显著升高，可能发生了C4光合碳同化途径的适应性增强。 （2）转录和代谢关联分析结果显示，MT的光合碳同化效率降低，光合电子传递最终电子受体NADP+供应不足，可能是其大量ROS产生并积累的主要原因；ROS水平的升高导致膜脂过氧化并触发了细胞凋亡进程，加速了叶绿素b和PSII捕光天线蛋白LbcB2的降解；此外，ROS作为信号物质反馈调节了谷胱甘肽循环、苯丙烷代谢和类黄酮代谢等通路基因的上调表达参与氧化应激反应，同时下调表达了捕光天线蛋白基因以减少光能捕获。 （3）比较蛋白质组分析结果显示，强光处理显著抑制了MT中光合作用-天线蛋白及光合作用通路蛋白的积累，光系统的完整组装受到限制；强光还诱导了MT中大量参与DNA复制的酶上调表达，可能与MT中大量积累的ROS造成DNA或蛋白质的氧化损伤激活了DNA损伤修复机制有关。光抑制引发的光系统蛋白稳态失衡，导致富含叶绿素的捕光天线蛋白丰度的降低是MT叶绿素含量显著降低的主要原因。 （4）采用分离群组重测序关联分析将突变候选基因定位到了chr7上2.4Mb的候选区间，包含4个非同义突变候选基因；qRT-PCR表达分析显示，编码叶绿体过渡性淀粉磷酸化水解所必需的磷酸葡聚糖水二激酶（PWD）基因（MELO3C017735T2）在MT中显著上调表达，蛋白亚细胞定位于叶绿体中；MT中叶绿体淀粉含量昼夜周期始终高于WT，且候选基因CmPWD沉默后叶色褪绿，可能为哈密瓜黄绿叶突变目的基因。 【结论】综合光合生理、转录组、蛋白组和代谢组数据及候选基因的定位筛选与功能验证，初步得出哈密瓜黄绿叶突变可能的生理及分子机制：突变体中CmPWD基因发生非同义突变导致PWD蛋白功能缺失，阻碍了叶绿体过渡性淀粉的磷酸化水解，过量积累的淀粉限制了MT的光合碳同化效率，使得光系统线性电子传递最终电子受体NADP+供应不足，产生并积累了大量的ROS并诱导了氧化应激反应；ROS一方面直接对光系统蛋白造成氧化损伤，加速蛋白的降解并抑制了光系统的组装修复，导致叶绿体结构的异常。另一方面通过质体信号转导途径反馈调节了MT中ROS清除相关代谢通路基因的上调表达缓解氧化损伤，同时抑制核编码捕光天线蛋白基因的表达以减少过剩光能的捕获；MT光系统中叶绿素a/b结合蛋白水平的显著降低，导致叶绿素含量大幅下降，类胡萝卜素比例升高而呈现黄绿叶表型。MT中C4和CAM途径的适应性增强可能是其光合碳代谢效率降低的一种适应性调节。
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