摘要
目的：巨噬细胞是一种免疫细胞，巨噬细胞所介导的炎症反应在各类慢性以及急性炎症性疾病中都发挥着重要的作用。近年来研究发现，巨噬细胞炎症反应及其介导的炎性细胞死亡细胞焦亡在加剧组织损伤和各类炎症性疾病发病中发挥关键作用，通过特异性抑制或基因敲除细胞焦亡信号通路的重要标志蛋白，如NLRP3、Caspase-1或GSDMD，则可有效抑制巨噬细胞焦亡和炎症的发生发展。因此，以焦亡及其信号通路作为重要干预靶点为调节炎症性疾病提供崭新的思路。硫化氢（HydrogensulfideH2S)在体内可以发挥抗炎、抗焦亡、抗凋亡、抗氧化应激等作用。硫巯基化修饰被认为是H2S发挥生物学功能、调节蛋白活性和发挥抗炎作用的关键机制。但目前仍不清楚H2S通过何种机制来抑制巨噬细胞焦亡，从而发挥其抗炎作用。因此本研究旨在建立体外细胞焦亡模型，通过使用脂多糖（Lipopoiysaccharide,LPS）和腺苷-5-三磷酸二钠盐（Adenosine5''-triphosphatedisodiumsalthydrate,ATP）刺激PMA诱导的THP-1巨噬细胞分化，模拟炎症环境下的细胞焦亡过程。探究H2S是否可以通过硫巯基化修饰Pro-Caspase-1抑制LPS+ATP刺激的巨噬细胞焦亡。 方法：本课题以THP-1细胞为研究对象。首先采用100ng/mL的PMA刺激THP-1人单核巨噬细胞24h诱导其分化为巨噬细胞。随后，采用H2S供体NaHS、LPS+ATP或联合干预经PMA诱导的THP-1细胞，分为以下4个组:（1）对照组组;（2）NaHS干预组;（3）LPS+ATP干预组;（4）LPS+ATP+NaHS干预组。采用亚甲基蓝比色法检测各组细胞内的H2S含量，采用Hoechst33342/PI染色和LDH释放检测各组细胞的焦亡程度，采用Caaspase-1试剂盒检测各组细胞的Caspase-1酶活性；采用ELISA检测THP-1巨噬细胞培养上清中IL-1β和IL-18的水平；采用WesternBlot检测各组细胞焦亡信号通路关键标志蛋白GSDMD-N、GSDMD、Caspase-1（P45）、Pro-IL-1β、Pro-IL-18、以及细胞上清蛋白Caspase-1(p20)、IL-18和IL-1β的表达。 为确定H2S是否通过硫巯基化修饰Pro-Caspase-1降低Caspase-1活性，从而抑制巨噬细胞的焦亡。我们将以THP-1来源的巨噬细胞为研究对象，分为以下6组：（1）control组；（2）NaHS组；（3）LPS+ATP组；（4）DTT组；（5）LPS+ATP+NaHS组；（6）DTT+NaHS组。采用生物素转换法检测Pro-Caspase-1的硫巯基化修饰水平。 结果：（1）H2S含量测定结果显示，与空白对照组相比，LPS+ATP刺激组H2S含量明显减少（P＜0.01）；给予NaHS预干预后，H2S含量有所增加（P＜0.05)。（2）光镜下各组细胞焦亡形态学观察结果显示，与空白对照组相比，LPS+ATP组THP-1巨噬细胞可发生明显肿胀膨大，带有泡状突出物为特点的细胞焦亡形态比例增加；而给予NaHS预处理可明显改善LPS+ATP干预的THP-1巨噬细胞焦亡形态。（3）Hoechst33342/PI染色和LDH释放结果显示，与空白对照组相比，LPS+ATP组可使THP-1巨噬细胞PI阳性细胞比例和LDH释放增加（P＜0.01）；而NaHS预干预可使THP-1巨噬细胞PI阳性细胞比例和LDH释放降低（P＜0.01或P＜0.05）。（4）ELISA测定结果显示，与空白对照组相比,LPS+ATP联合干预可显著增加细胞上清中IL-1β和IL-18的水平（P＜0.01）；而NaHS和LPS+ATP联合干预则可显著降低细胞培养液上清中的IL-1β和IL-18水平（P＜0.05）。(5)WesternBlot结果显示，与空白对照组相比，LPS+ATP可显著上调THP-1巨噬细胞中细胞焦亡关键标志蛋白NLRP3、GSDMD和GSDMD-N末端片段的表达（P＜0.05或P＜0.01）；与LPS+ATP组相比，NaHS和LPS+ATP联合干预则可显著抑制NLRP3、GSDMD和GSDMD-N焦亡关键蛋白的表达（P＜0.05或P＜0.01）。（6）生物素转换（BiotinSwitchAssay）和活性实验结果显示，在无外源性H2S的情况下，Pro-Caspase-1存在本底水平的硫巯基化修饰；单独给予NaHS处理可以进一步增强Pro-Caspase-1的硫巯基化修饰水平（P＜0.01）；然而，用硫巯基化修饰清除剂DTT处理则显著降低了内源性和外源性H2S诱导的Pro-Caspase-1的硫巯基化修饰水平（P＜0.05或P＜0.01）。与对照组相比，给予DTT可显著提高Caspase-1的酶活性(P＜0.01）；与NaHS组相比，给予DTT处理后可增加Caspase-1的酶活性（P＜0.05）。与对照组相比，LPS+ATP刺激降低了THP-1来源的巨噬细胞中Pro-Caspase-1的巯基化修饰水平，并伴随着Caspase-1活性增加和成熟IL-1β、IL-18和Caspase-1（P20）的释放增加（P＜0.05或P＜0.01）；给与NaHS预处理后LPS+ATP引起的硫巯基修饰Pro-Caspase-1的减少有所恢复，同时减少了Caspase-1酶活性和成熟IL-1β，IL-18和Caspase-1（P20）的释放（P＜0.05或P＜0.01）。 结论：LPS和ATP联合刺激可诱导THP-1巨噬细胞中NLRP3炎性小体的激活，进而导致Caspase-1前体（Pro-Caspase-1）的裂解和激活，诱导巨噬细胞焦亡，而H2S可以通过硫巯基化修饰Pro-Caspase-1抑制Caspase-1的活性进而抑制GSDMD、Pro-IL-1β和Pro-IL-18的裂解发挥抗焦亡作用。
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