摘要
花斑裸鲤（Gymnocypriseckloni）是我国青藏高原鱼类区系主体成分的代表物种。目前关于花斑裸鲤的研究多集中在形态特征、人工繁育、遗传进化等方面以及对高原环境的生理生化适应方面，而在红细胞发育分化的分子机制研究仍有所欠缺。本研究以花斑裸鲤为研究对象，通过染色观察鉴定、单细胞测序和DNApulldown技术手段，从红细胞形态学、细胞水平、分子水平三个层面开展了红细胞形态观察、造血器官单细胞测序、红细胞分化相关因子分析鉴定及DNApulldown实验，鉴定并统计了花斑裸鲤外周血红细胞及造血器官（肾脏、脾脏、肝脏）红细胞的组成类型、形态大小及占比情况，构建了造血器官（肾脏、脾脏、肝脏）的细胞图谱，厘清了红细胞分化相关因子的基因结构特征，探究了相关因子启动子与转录因子的结合情况，从更系统的角度解析了花斑裸鲤红细胞发育分化的分子调控机制，揭示了脊椎动物造血系统发育的高度保守性。主要研究结果如下： （1）采用姬姆萨染色技术，制备花斑裸鲤外周血血涂片以及肾脏、肝脏、脾脏三个造血器官的组织印迹片，利用光学显微镜进行花斑裸鲤红细胞形态特征观察及类型鉴定，通过SPSS等软件完成不同类型红细胞胞体长径、短径，红细胞细胞核长径、短径的统计分析以及不同类型红细胞在外周血、肾脏、肝脏、脾脏中的占比计算。发现花斑裸鲤的红细胞发育成熟过程经历了原红细胞、幼红细胞、成熟红细胞三个阶段，在外周血中的红细胞还能通过有丝分裂的方式进行增殖。并且推断肾脏和脾脏是花斑裸鲤红细胞发生和分化的主要场所，同时肝脏也参与了红细胞的发育分化，可能是花斑裸鲤造血发育的辅助器官。 （2）采用单细胞测序技术初步构建花斑裸鲤三个造血器官的细胞图谱，挖掘补充各细胞亚群的标记基因，分析各细胞亚群的主要功能，比较三个造血器官的细胞分布异质性。研究发现花斑裸鲤三个造血器官（肾脏、脾脏、肝脏）中的细胞可分为16个细胞亚群，包含12种细胞类型，分别是红细胞、中性粒细胞、T细胞、B细胞、树突状细胞、上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、肌细胞、成纤维细胞、单核细胞、神经细胞。结果与斑马鱼造血器官细胞类型相似，这证明了硬骨鱼类造血器官细胞发育进化的高度保守性。根据三个器官细胞分布异质性分析，进一步验证肾脏和脾脏是花斑裸鲤重要的造血器官，肝脏可能为辅助造血器官。 （3）利用TBtools软件对花斑裸鲤红细胞分化相关因子GATA1、KLF17、NPM1A、MCM2、MIBP的CDS序列及启动子序列进行提取，同时进行相应的分析与预测，发现花斑裸鲤GATA1、KLF17、NPM1A、MCM2、MIBP分别位于9号假定染色体、21号假定染色体、1号假定染色体、15号假定染色体、15号假定染色体，CDS序列全长分别为1257bp、1224bp、888bp、2670bp和606bp，分别编码418、407、295、889、201个氨基酸。并对它们启动子序列的转录因子结合情况进行了预测，结果表明GATA1、KLF17、NPM1A、MCM2、MIBP的启动子序列均含有与造血相关的转录因子的结合位点，证明它们可能参与造血发育的调控，为进一步解析花斑裸鲤红细胞发育分化机制提供科学参考。 （4）利用DNApulldown技术，结合GATA1、KLF17、NPM1A、MCM2、MIBP的启动子序列转录因子的结合预测情况，并利用DNApulldown技术钓取GATA1、KLF17、NPM1A、MCM2、MIBP启动子结合蛋白。结果表明，在花斑裸鲤肾脏组织中GATA1、KLF17、NPM1A、MCM2、MIBP分别筛选到453、576、374、243、223个特异性结合的蛋白，去除未能鉴定到的蛋白，分别有165、306、168、68、74个候选结合蛋白。候选结合蛋白中主要有参与红细胞发育相关的血红蛋白、组蛋白H3、组蛋白-赖氨酸甲基转移酶、E3泛素连接酶、细胞色素P450酶、核糖体蛋白、信号转导和转录激活因子、真核翻译起始因子2、转铁蛋白等。经过生物信息学分析，结果显示GATA1、KLF17、NPM1A、MCM2、MIBP通过调控组蛋白甲基化、乙酰化、泛素化、血红素生成、珠蛋白基因表达、铁代谢、血管生成、糖酵解等途径，来促进花斑裸鲤红细胞的生成、发育及分化，提示GATA1、KLF17、NPM1A、MCM2、MIBP在转录水平上参与组蛋白修饰及红细胞中血红素、铁和珠蛋白间的相互作用，为红细胞分化机制研究提供重要信息。
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