摘要
目的： 探讨黄精-当归药对（HuangjingandDangguidrugpair,HDP）通过调控PI3K-Akt-mTOR信号通路促进阿尔茨海默病（Alzheimer''sdisease,AD）小鼠海马神经自噬的分子机制，为该药的临床应用提供实验参考。 方法： 本动物实验研究包括：①验证HDP改善AD小鼠学习记忆功能及其药效变化；②探讨HDP调控AD小鼠大脑海马PI3K-AKT-mTOR信号通路机制；③探究HDP促进AD小鼠大脑海马神经细胞的自噬变化及其与相关信号的相关性。 将昆明小鼠随机分为AD组、阳性药物（多奈哌齐0.65mg/kg/d）组、HDP低剂量组（1.75g/kg/d）组、HDP中剂量（2.5g/kg/d）组、HDP高剂量（7.5g/kg/d）组，共6组，每组各15只小鼠。给予AD模型组、阳性药物组及HDP各剂量组小鼠颈背处皮下连续注射3周注射1%D-半乳糖液（140mg/kg/d），第4及5周改用东莨菪碱（2mg/kg/d）腹腔注射。各小鼠AD造模后第2周开始，同时给阳性药物组小鼠灌胃0.65mg/kg/d的多奈哌齐治疗4周，给HDP各剂量组小鼠灌胃相应剂量的HDP提取液治疗4周。给药操作结束后，采用Morris水迷宫进行为期七天的试探试验、反转试验、可视平台试验以检测各组小鼠的记忆能力、学习能力差异。进行HE染色和尼氏染色，分析各组小鼠大脑神经形态结构及神经元数量变化。RT-qPCR法检测各组小鼠海马神经PI3K、AKT、mTORmRNA表达变化；免疫组化法检测各组小鼠海马神经细胞内PI3K、AKT、Beclin-1和VPS34蛋白阳性表达变化；Westernblot检测各组小鼠海马神经中通路关键蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、LC3B、P62、Beclin-1的表达差异。 结果： 1.水迷宫行为学检测：在试探实验中，AD组小鼠平台象限停留时间较空白对照组显著减少（P＜0.01）；而各给药组（阳性药物组与HDP各组）小鼠停留平台象限时间较AD模型组明显增长（P＜0.05,P＜0.01）。且在反转实验中，AD组小鼠找到平台的时间显著多于正常组（P＜0.01），各给药组小鼠找到平台时间显著低于AD组小鼠（P＜0.01）。1.75-7.5g/kg/d剂量内的HDP治疗AD小鼠作用呈现出剂量依赖关系，说明HDP能有效增强AD小鼠的记忆能力与再学习能力，可改善AD小鼠的痴呆症状。 2.神经病理切片检测：通过HE染色及尼氏染色后镜下观察切片细胞数量及细胞形态可知，较空白对照组而言，AD组小鼠大脑皮质S1Tr区及大脑海马区CA1、CA3区的神经元数量明显减少，且细胞排列松散不均，胞内结构紊乱，神经细胞染色较浅或不均匀，且可见细胞体积肿胀明显且神经细胞内部呈空泡样改变，细胞核存在不同程度固缩（P＜0.01）；各给药组小鼠大脑神经数量较AD组显著增加，排列相对紧凑均匀，神经元胞质胞核染色相对均匀加深，胞质及胞核核仁变性固缩现象明显减轻（P＜0.05，P＜0.01）。 3.PI3K-AKT-mTOR信号通路重要因子表达检测：RT-qPCR结果显示，AD组小鼠海马神经PI3K、AKT及mTORmRNA表达量均较对照组显著降低（P＜0.01）；各给药组小鼠海马神经PI3K、AKT及mTORmRNA表达水平均较AD组均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。免疫组化结果显示，AD组小鼠海马CA1、CA3、DG区的PI3K、AKT的阳性表达量均显著降低（P＜0.01）；各给药组小鼠海马PI3K、AKT的阳性表达量均显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。Westernblot结果显示，AD组小鼠海马神经PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR蛋白表达水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR比值均较正常对照组显著降低（P＜0.01）；各给药组小鼠海马神经PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR及p-mTOR蛋白表达水平、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR比值均较AD组显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。 4.海马神经细胞自噬各重要因子检测：免疫组化结果显示，AD组小鼠海马神经Beclin-1和VPS34阳性表达量较空白对照组均显著降低（P＜0.01）；各给药组小鼠海马神经Beclin-1和VPS34阳性表达量均较AD组显著升高(P＜0.05，P＜0.01)。Westernblot结果显示，AD组小鼠海马神经自噬相关蛋白LC3B和Beclin-1蛋白表达水平均较空白对照组显著降低（P＜0.01）；各给药组小鼠海马神经LC3B和Beclin-1蛋白表达水平均较AD组显著上升(P＜0.05，P＜0.01)。 结论： 1.HDP可明显改善AD小鼠的学习和记忆功能。 2.HDP激活PI3K-AKT-mTOR信号通路以促进海马神经细胞自噬是其治疗AD的重要机制之一。
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