摘要
葎草酮、合葎草酮、加葎草酮是啤酒花苦味酸中α-苦味酸的主要成分，不仅可作为风味剂为啤酒提供苦味，还有防腐、镇静、抗病毒、抗肿瘤等药理作用。鉴于提取法和化学合成法在制备结构复杂的高纯度苦味酸时具有局限性，本研究拟建立高纯度α-酸的生物合成途径。目前已有的研究未解析α-苦味酸天然生物合成途径的最后一个酶，即催化前体脱氧α-苦味酸至目标α-苦味酸的氧化酶，基于实验室已有的研究基础可推测其是一种单加氧酶。本研究从实验室已验证的可用于催化脱氧葎草酮至葎草酮的单加氧酶(啤酒花葎草酮合成酶1，mo1)出发，筛选来源于啤酒花的另一种单加氧酶(啤酒花葎草酮合成酶2，mo2)，通过计算机模拟和实验验证的方法研究两个候选酶对不同底物的选择性和催化机理，而后利用明确的催化途径构建合成葎草酮、合葎草酮、加葎草酮的工程菌，并进一步进行葎草酮、合葎草酮、加葎草酮的发酵、分离和鉴定。 本研究从来源于啤酒花的两种单加氧酶mo1和mo2出发，首先利用计算机模拟计算构建蛋白模拟结构并对两种酶对不同脱氧α-苦味酸底物(α-苦味酸的前体)的催化选择性进行分析。计算机模拟计算结果显示，模拟建模的mo1结构对脱氧葎草酮底物有更好的选择性，而模拟建模mo2结构对脱氧合葎草酮底物有更好的选择性。 本研究进一步在生物合成实验中验证计算机模拟计算结果，利用基因工程和代谢工程技术，将完整的α-苦味酸天然合成代谢途径的关键酶导入工程大肠杆菌菌株，成功构建产葎草酮、合葎草酮和加葎草酮的工程菌株。其中产葎草酮工程菌表达来源于啤酒花的羧基辅酶A连接酶CCL2，单加氧酶mo1/2；产合葎草酮工程菌表达来源于啤酒花的羧基辅酶A连接酶CCL4，单加氧酶mo1/2；产加葎草酮的工程菌表达来源于啤酒花的羧基辅酶A连接酶CCL4，单加氧酶mo1/2。此外，六个工程菌均表达α-苦味酸共有的关键酶，包括来源于啤酒花的异戊二烯基转移酶(PT1/2)和间苯三酚合酶(VPS)以及异戊二烯基焦磷酸异构酶(IDI)。本研究同时构建产甲羟戊酸的工程菌。 产甲羟戊酸、葎草酮、合葎草酮、加葎草酮工程菌株经过验证后在200mL摇瓶水平进行甲羟戊酸、葎草酮、合葎草酮、加葎草酮的生物合成研究。其中产甲羟戊酸工程菌可有效制备甲羟戊酸，为α-苦味酸的发酵提供了前体保障。在α-苦味酸的发酵过程中，添加异戊酸/异丁酸/2-甲基丁酸与甲羟戊酸作为前体底物可有效提高α-苦味酸的合成效率。其中异戊酸/异丁酸/2-甲基丁酸的添加提高了α-苦味酸中心结构的合成效率；甲羟戊酸的添加为C5单元二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)提供了前体保障。α-苦味酸在72h结束发酵后成功对发酵产物进行分离纯化。通过液质和液相的定性定量分析结果显示本研究成功合成了α-苦味酸。 发酵结果证明本研究筛选的单加氧酶mo1参与葎草酮的生物合成途径，与计算机模拟结果相吻合，含单加氧酶mo1的工程菌在摇瓶水平制备葎草酮的产量可达到0.775g/L。发酵结果证实单加氧酶mo2参与合葎草酮的生物合成途径，与计算机模拟结果相吻合，但产物液质检测结果显示，合葎草酮产物纯度低，只是零星产出，后续需要继续研究如何高产量生产合葎草酮。本研究进行了加葎草酮生物合成研究，发现含单加氧酶mo1的菌株发酵产物中含有加葎草酮的前体脱氧加葎草酮，但发酵产物杂质较多，是否含有加葎草酮还需进一步纯化分析，本实验室后续会对加葎草酮的生物合成进行进一步研究。 本研究验证了两种单加氧酶对不同α-苦味酸前体底物的选择性，填补了α-苦味酸天然生物合成途径中的最后一块短板。并成功利用构建的工程大肠杆菌成功制备了高纯度葎草酮，零星生产出合葎草酮。本研究也为后续全系苦味酸的生物合成研究提供了学术参考和依据。
NETL