摘要
我国饲料资源短缺问题严重，挖掘植物饲料中纤维供能潜质、提高饲料资源利用率愈显重要。植物细胞壁中阿魏酸与半纤维素和木质素共价交联，结构复杂，阻碍了木质纤维的降解利用。阿魏酸酯酶，可作用于阿魏酸与多糖之间的酯键，促进植物纤维降解。提高阿魏酸酯酶基因表达和分子催化效率是阿魏酸酯能否应用于高效降解植物纤维的关键。本论文以已报道酶学性质和催化活力较好的阿魏酸酯酶基因为初始目的基因，分别在大肠杆菌BL21（DE3）或枯草芽孢杆菌WB800N中进行表达，以期获得高表达量的宿主菌，并对其与纤维水解酶协同效应进行研究，同时利用易错PCR技术对高表达目的基因进行定向进化，获得催化和表达效率较高突变体。探究在肉仔鸡日粮中添加含木聚糖酶、纤维素酶等的黑曲霉X1固态发酵物及阿魏酸酯酶，替代部分能量对鸡生长的影响。研究结果如下： （1）不同来源的阿魏酸酯酶基因异源表达及与不同纤维水解酶的协同应用。经文献检索，获取2种阿魏酸酯酶基因BpFAE、FAESH1及一种乙酰木聚糖酯酶基因AXE。将BpFAE、FAESH1分别转化到BL21（DE3）、WB800N中，AXE仅转化到WB800N中，其中3个基因在枯草芽孢杆菌WB800N中均成功表达，但酶活较低，无法应用，FAESH1在大肠杆菌中未能表达，原因有待进一步研究，而BpFAE在大肠杆菌中表达量较高，且胞内外可溶性表达，胞外酶活为3.61U/mL，经镍柱纯化后比活力为243.03U/mg。在不同纤维水解酶组合（木聚糖酶、木聚糖酶＋呋喃糖苷酶和木聚糖酶＋呋喃糖苷酶＋纤维素酶）基础上添加BpFAE蛋白15μg，协同水解去淀粉麦麸，还原糖产量分别提高了109.10%、40.03%、28.44%，证明阿魏酸酯酶BpFAE与纤维水解酶有协同作用。 （2）定向进化提高阿魏酸酯酶比活力。采用易错PCR技术对BpFAE基因进行改造，成功构建突变文库，并通过阿魏酸乙酯平板筛选方法进行复筛，获得突变体7株。经对胞外酶活测定及蛋白比活力测定，成功获得S12N、L70I/S225L、D41V三株正向突变体，胞外酶活分别提高68.98%、21.61%、197.23%，比活力分别提高57.81%、5.01%、45.98%。其中突变体D41V胞内外蛋白表达量均远高于其他菌株。以不同C链长度对硝基苯酚酯作为底物（C4、C6、C8、C12、C16）测定比活力，所有酶蛋白均对C12、C16无活性。与野生型相比，突变体D41V对C4、C6、C8底物比活力分别提高了6.04%、21.95%、51.52%。这说明D41V可能水解含有阿魏酸酯键大分子底物的能力较强。 （3）阿魏酸酯酶改善肉仔鸡日粮饲料能值研究。日粮中分别添加X1固态发酵物和X1固态发酵物＋阿魏酸酯酶替代不同能量后，与基础日粮组相比，实验组肉仔鸡全期（1~42日龄）的平均日增重和平均日采食量及料重比均无显著差异。添加多种酶后提高了纤维物质的利用效率，起到了替代部分日粮能量的作用。 综上可见，阿魏酸酯酶可提高纤维水解酶水解去淀粉麦麸的效率。阿魏酸酯酶BpFAE第41位的天冬氨酸突变成缬氨酸后，提高了蛋白表达量、比活力和水解大分子酯键的能力，为高催化活性阿魏酸酯酶的开发利用提供了参考。在不同生长阶段的肉鸡饲料日粮中分别添加纤维水解酶及阿魏酸酯酶后，促进了饲料中能量的释放，可起到替代日粮能量的作用，且阿魏酸酯酶起到促进纤维水解酶的作用。
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