摘要
痛风的发生源于尿酸水平过高和尿酸钠晶体积累，长期累积可引发关节炎症并损害多个器官，严重威胁生命。目前，临床使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂种类较少，存在各种不良反应，寻找高效且低毒的酶抑制剂具有极为重大的意义。天然产物种类多，安全，具备新药开发的潜力。配体垂钓相比传统的活性化合物筛选方法具有特异性强、效率高等优点。本文建立了一种基于配体垂钓结合液相色谱-高分辨质谱(UPLC-QTOF-MS/MS)联用技术的筛选方法，旨在从丰富的天然产物中筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂。主要内容包括： 1.分别研究了戊二醛交联硅烷化磁颗粒、磁性壳聚糖微球和氧化石墨烯Fe3O4纳米复合材料这几种磁颗粒对黄嘌呤氧化酶固定化效果的影响。结果发现相比之下戊二醛交联硅烷化磁颗粒固定化黄嘌呤氧化酶展现出了良好的固定化率和酶活回收率。并且优化了酶固定化条件，结果表明，在黄嘌呤氧化酶浓度为2mg/mL，固定化时间为2h，固定化温度为25℃，缓冲液pH为7.0，当戊二醛的浓度达到5%时，其固定化酶的效果表现最为优越，固定化率为69.3%，酶活回收率为38.3%。 2.以最佳的固定化条件制备了固定化黄嘌呤氧化酶，并比较了固定化酶与游离酶的酶学性质，结果表明，游离酶与底物黄嘌呤的最佳催化反应温度为30℃，固定化酶则在37℃时表现出最佳的反应效率，表明固定化酶有更好的温度适应性；游离黄嘌呤氧化酶与固定化酶均在pH为7.0的条件下催化反应性能最优；固定化酶在pH7.0的缓冲溶液中70℃保温1h后仍能保持45.2%的酶活力，而游离酶仅为8.1%；固定化酶在pH为7.5的缓冲溶液中4℃保存2h后酶活力最稳定，而游离酶在pH7.0的缓冲液中最稳定；固定化酶在循环使用7次后仍能保持48.1%的活性；在30℃、40℃、50℃的条件下，固定化酶的失活半衰期分别是游离酶的2.51、1.90和1.91倍，固定化酶相较于游离酶，其对温度的波动具有更低的敏感性；与游离黄嘌呤氧化酶相比，磁性载体固定化黄嘌呤氧化酶有着更好的温度适应性、pH适应性、热稳定性、pH稳定性、有机试剂的耐受性以及重复利用性。通过扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）以及X-射线衍射（XRD）表征了固定化酶的结构。傅里叶变换红外光谱二级结构分析表明，酶经过固定化处理后，其二级结构发生了显著的改变，固定化酶的α-螺旋增加了5.20%，β-折叠减少了2.24%，无规则卷曲含量增加了4.53%，β-转角减少了7.49%，经过固定化处理后，酶展现出了更加优越的刚性与稳定性。 3.使用磁性纳米颗粒固定化酶，利用配体垂钓技术从天然产物中黄嘌呤氧化酶活性抑制效果较好的葛根和黄芩提取物中得到黄嘌呤氧化酶抑制剂，并用UPLC-QTOF-MS/MS鉴定，得到葛根中的葛根素和大豆苷，黄芩中的黄芩素、黄芩苷和汉黄芩素展现出了对黄嘌呤氧化酶的抑制活性。利用DiscoveryStudio分子对接软件对筛选出的化合物和黄嘌呤氧化酶进行分子对接模拟，通过评分函数判断化合物的黄嘌呤氧化酶抑制活性，并对体外黄嘌呤氧化酶活性抑制效果进行了测定，以此对配体垂钓酶抑制剂筛选方法进行验证。
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