摘要
本文以艾叶挥发油为研究对象，通过全二维色谱系统对其化学成分进行分离分析，并对艾叶挥发油及其中有效成分的抗菌活性及抗菌作用机制进行探讨。首先，通过建立全二维逆流色谱×气相色谱系统对艾叶挥发油的化学成分进行分离与表征，并进一步探讨该全二维色谱机制的正交性及其分离能力。然后，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为供试菌，通过建立薄层色谱-生物自显影法与全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术，快速筛选并精确鉴定出艾叶挥发油中具有抗菌活性的物质，并进行体外抗菌活性验证。最后，研究α-松油醇对金黄色葡萄球菌的抗菌作用机制。主要内容如下： （1）建立了全二维逆流色谱×气相色谱分离体系，将其首次应用于艾叶挥发油的化学成分研究，并对全二维色谱体系的正交性进行评价。首先，以正己烷-乙腈-甲醇（2∶2∶1，v/v/v）作为两相溶剂体系，对艾叶挥发油进行第一维逆流色谱分离。然后，采用气相色谱对收集得到的所有馏分进行第二维分析。接着，通过建立二维等高线图谱，实现了化学成分分离的可视化，所分离的化合物可划分为六个区域。将化合物经气相色谱-质谱联用仪鉴定，可将六个区域中的物质按照结构分类为单萜、倍半萜、单萜醇、酚类、醛类、酮类、酯类等，实现化学成分的分类分离。进一步地，对总峰容量和正交性进行评价，通过全二维色谱分离得到了约1392个峰、高空间覆盖率和低线性相关系数，表明该二维色谱系统具有良好的正交性。最后，对六个区域中的物质进行抗菌活性测定，发现显示出明显的“抗菌活性区域化”，区域Ⅰ和Ⅱ较其它区域的物质显示出显著的抗菌活性。 （2）首次建立了薄层色谱-生物自显影法与全二维气相色谱-飞行时间质谱联用技术，快速筛选和鉴定出艾叶挥发油中的抗菌活性成分，为阐明艾叶挥发油的抗菌活性物质提供基础。首先，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为供试菌，通过MIC、MBC和IC50三个指标对艾叶挥发油的体外抗菌活性进行初步评估。接着，采用薄层色谱-生物自显影法快速定位艾叶挥发油中的抗菌活性成分簇，并将其制备得到。进一步地，采用全二维气相色谱-飞行时间质谱仪对生物活性簇进行鉴定，并对含量较高的6个化合物进行体外抗菌活性验证。所有被测试的成分均显示出抗菌活性。其中，α-松油醇和丁香酚所显示的显著抗菌活性具有临床意义（MIC＜0.62mg/mL）。 （3）首次探究了艾叶挥发油中活性物质α-松油醇对金黄色葡萄球菌的抗菌作用机制。主要通过围绕抑菌-生长曲线、细胞壁完整性、细菌胞内核酸和蛋白质泄露含量、细胞膜通透性和完整性、呼吸代谢、细菌形态观察、细菌细胞活力以及可溶性蛋白含量与表达等指标展开研究。实验结果表明，α-松油醇对金黄色葡萄球菌的抑制作用表现出较强的浓度依赖性和较低的时间依赖性。此外，α-松油醇会对细菌细胞壁的完整性和细胞膜的通透性产生破坏，导致胞内大分子物质泄露。同时，α-松油醇还会影响细菌的呼吸代谢、外观形态、细胞活力和蛋白表达等，导致细菌无法正常生长繁殖，最终无法生存，从而达到抑菌效果。
NETL