摘要
咖啡酸衍生物具有重要药用价值，如咖啡酸苯乙酯和咖啡酸苯乙胺（CAPE和CAPA）同时具有抗菌、抗氧化和潜在抗肿瘤作用。相比于植物提取和化学合成，微生物合成CAPE和CAPA具有独特优势。酿酒酵母作为真核模式生物，改造策略丰富，具有作为工程化底盘的优势，因此本研究尝试以酿酒酵母为底盘构建CAPE、CAPA从头合成的细胞工厂。 首先，本研究以含有合成型Ⅴ号Ⅹ号染色体的酿酒酵母菌株SynⅤⅩ为底盘，引入PahpaB、SehpaC、LlkivD、ScEHT1、At4CL、RtTAL的表达模块，通过同源重组，构建了CAPE的合成路径；利用类似方法，引入PahpaB、SehpaC、LbPDC、CaTHT、At4CL、RtTAL的表达模块，构建了CAPA的合成路径。经初步发酵未检测到目标产物，因此分别通过构建含有单独模块菌株以及前体物转化测试，确证了RtTAL可将L-酪氨酸转化为对香豆酸，PahpaB、SehpaC可将对香豆酸转化为咖啡酸，LlkivD可将L-苯丙氨酸转化为2-苯乙醇，At4CL和ScEht1可将咖啡酸和2-苯乙醇合成出CAPE，LbPDC可将L-苯丙氨酸转化为2-苯乙胺，而At4CL和CaTHT可将咖啡酸和2-苯乙胺合成出CAPA。产物LC-MS/MS定性分析确定CAPA路径产生副产物对香豆酸苯乙胺（p-CoPA）。通过对四种芳香族化合物提取方法的对比，确定了一种用于本体系产物提取简便、高效方法。 进一步分析发现，At4CL可同时催化咖啡酸和对香豆酸产生各自的酰基辅酶A，这导致副产物p-CoPA的产生。为了将代谢流引向主产物，本研究对At4CL模块进行了两种改造：其一，构建At4CL与CaTHT的融合基因，希望其能更偏向利用咖啡酸；其二，构建GAL诱导At4CL延迟表达以使对香豆酸先转化为咖啡酸，结果证明，两种改造都不太理想。研究通过不同来源hpaBC在不同组装方式和不同底盘中的表达，确定了提高NADPH辅酶供应可显著提升咖啡酸产量。 最终，本研究以L-苯丙氨酸和L-酪氨酸合成路径改造的菌株SCY5为底盘，实现了以葡萄糖为碳源从头合成CAPE和CAPA，产量分别为419±4μg/L和483±66μg/L。但是，前体转化效率不足、副产物的产生等问题尚未彻底解决，提高关键酶4CL的选择性和THT/EHT1的活性在将来研究中需重点关注。综上，本研究首次在酿酒酵母中实现CAPE和CAPA的从头合成，并合成出过程产物咖啡酰辅酶A、对香豆酰辅酶A、苯乙醇、苯乙胺，为探索酿酒酵母内生产高附加值咖啡酸衍生物及其它植物源芳香族衍生物提供了参考。
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