摘要
【研究背景】细胞外微环境的力学信号对细胞增殖、分化和死亡的重要调控作用不断被发现，生物力学信号的相关研究为多种疾病的治疗提供了新的切入点。在人体所有组织器官中，骨组织的力学信号敏感性高，当骨组织的生物力学环境发生变化，骨重建的方向会随之改变。在骨骼系统中，骨基质的硬度是细胞周围重要力学信号之一。骨组织的硬度可因老化和影响矿物质成分结构的常见疾病而改变，如骨质疏松症、骨硬化病、骨骼高磷血症、牙周病和骨关节炎等，这些疾病的发生改变了骨骼细胞的微环境。骨组织的成分细胞主要包含成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、软骨细胞及其祖细胞和骨髓干细胞。其中，破骨细胞是人体内唯一具有骨吸收功能的细胞，是引导骨重建的关键，在维持骨代谢稳态中具有重要作用。破骨细胞的功能具有两面性：一方面，破骨细胞具有促进骨骼生长，更新和控制局部血钙浓度等多种功能。在骨组织工程领域，活性破骨细胞作为骨重建的起点为成骨细胞和内皮细胞形成新自体骨组织创造空间。另一方面，关于破骨细胞分化调控机制的研究仍然存在很多不确定性，例如其分化不稳定性，对微环境信号高度敏感，在成熟和凋亡之间的快速转换，使其被定义为容易“失控”的细胞，而其功能的异常又常导致多种骨骼疾病的发生。因此了解破骨细胞受多种生物学信号的调控机制是破解骨代谢及骨骼系统疾病的先决条件。本课题组前期研究发现，病理性骨基质硬度的下降改变了骨细胞活性和细胞间交流的能力。细胞外基质硬度的改变对于软骨细胞、成骨细胞和骨髓间充质干细胞的分化均具有调控作用。然而这种病理生理状况下细胞外微环境硬度的变化对于破骨细胞的分化以及功能具有怎样的影响仍不清晰。破骨细胞生物学功能的哪些方面受到细胞外基质力学信号的调节，以及通过哪些机制调节，目前在很大程度上没有明确答案尚需深入探索。 【研究目的】 1.观察骨基质硬度随病理状况发生显著变化时，体内已有破骨细胞以及在外力作用下招募参与骨重建的破骨细胞活性是否发生变化。 2.使用生物材料构建力学模型，模拟细胞外基质硬度变化的微环境。体外研究细胞外基质硬度对破骨细胞分化及功能的影响。 3.初步探索基质硬度力学信号通过粘着斑复合体和Wnt通路在破骨细胞内传递的可能机制。 【研究方法】 1. 双侧卵巢切除（Ovariectomy, OVX）构建病理性骨硬度变化的小鼠模型，通过使用µCT、组织学染色和三点弯曲实验对建立的小鼠模型进行表征分析。在已构建的骨硬度变化模型上，使用TRAP染色检测已有破骨细胞的数量。通过设计正畸牙移动实验，以小鼠上颌前牙为支抗近中移动第一磨牙，应用TRAP染色和Hamp;E染色检测第一磨牙近中颊侧牙根处的破骨细胞招募和骨重建状况。 2. 应用生物材料聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）制作梯度硬度基质以模拟细胞外微环境的硬度变化。使用 AFM、SEM 和力学性能实验对材料基质进行表征分析。应用活细胞成像记录和SEM从基本细胞行为学层面研究破骨细胞形态表征和融合分裂选择的变化。应用RNA-seq技术，获取培养在软硬PDMS基质上的破骨细胞转录组信息，对破骨细胞分化标志物基因集的富集程度进行生物信息学分析，并使用WB，IF和RT-PCR等技术对其进行实验性验证。最终对破骨细胞的终末分化骨吸收功能进行检验，包含TRAP染色、骨片吸收陷窝、破骨细胞酸化等方面。 3. 在已建立的人工细胞外基质硬度变化模型上，探索基质硬度力学信号在破骨细胞内的传递机制。结合RNA-seq数据对差异基因进行富集分析、KEGG 分析和文献回顾筛查潜在力学传递目标蛋白。应用siRNA转染、腺病毒过表达、IF、Co-IP、WB和IPP等实验技术，从多个层面对破骨细胞力学信号的传递机制进行验证和探索。 【研究结果】 1.成功构建基于 OVX 骨质疏松小鼠的体内骨硬度变化模型，并发现股骨远端、股骨头和上颌第一磨牙近远中颊根间牙槽骨的骨量丢失。骨小梁指数包含 BV/TV、Tb. N、Tb. Th 和 Tb. Sp 均显著变化。OVX 诱导骨质疏松小鼠的力学性能、骨组织硬度（以弯曲弹性模量衡量）、最大弯曲应力和极限力相比于对照组显著降低。OVX较长时期后（24周），骨组织内破骨细胞激活信号相对平稳，OVX组RANKL表达量与对照组没有显著差异。OVX组股骨及牙槽骨目标区域内破骨细胞的形成数量明显少于对照组，且正畸力作用下压力侧和张力侧所招募破骨细胞的数目均降低，骨基质硬度与破骨细胞活性具有正相关性。 2.成功制备出具有五种不同硬度的 PDMS 基质，弹性模量变化为 4.05 MPa～0.03 MPa，固化剂与弹性体的比例分别为 1∶5、1∶15、1∶30、1∶45、1∶60。不同硬度PDMS材料拓扑结构具有一致性，排除了表面拓扑结构对破骨细胞分化的影响。破骨细胞在硬PDMS基质上铺展面积更趋向于成熟，可与周围细胞快速融合转化为较大体积的破骨细胞。而在软PDMS基质上，小破骨细胞间的融合被破坏，分裂事件占优势。RNA-seq结果显示破骨细胞分化特异性基因在硬基质上培养的细胞内富集，细胞外基质硬度的增高趋向于促进破骨细胞分化的转录组表达。实验性验证发现 Nfatc1、Ctsk、DC-stamp、NF-kB p65、Traf6、Mmp9、Acp5、Camk2a基因或其编码蛋白的表达量与RNA-seq测序结果一致。通过检测在软硬骨片上培养破骨细胞的骨吸收陷窝、骨基质降解酶活性以及细胞酸化程度发现，细胞外基质硬度的增高促进破骨细胞向终末分化，增强了其骨吸收功能与细胞酸化程度，与破骨细胞分化转录谱的改变具有一致性。 3.通过对破骨细胞力学传递机制的探索，发现粘着斑-细胞骨架信号轴可传递细胞外基质硬度信号。首先使用高分辨率激光共聚焦显微镜头捕获到，在软硬基质上培养的破骨细胞骨架结构具有显著差别。进一步通过RNA-seq中差异基因KEGG通路的富集分析，发现排序前20的KEGG通路中，细胞粘附分子（Cell adhesion molecules）通路涉及的差异表达蛋白数目最多。结合实验性验证发现粘附相关 Integrin αvβ3 和 Fibronectin 蛋白的变化最为显著，且力学信号可通过ITGB3-Paxillin相互作用从细胞外基质向细胞内骨架调控通路传递信号，其下游的粘着斑复合体通路蛋白（p-PKC）和关键酶（FAK和RhoA）在破骨细胞内被激活。对粘着斑复合体以外的潜在破骨细胞力学传递通路进行筛查，发现破骨细胞分化中高表达的Wnt非经典通路家族成员对力学信号具有高度敏感性，存在以Wnt5a为首的大量Wnt信号通路基因的显著变化。Wnt5a沉默可以降低ITGB3、Paxillin、FAK、p-PKC和RhoA的蛋白表达量，消除了基质硬度力学信号对粘着斑通路蛋白的激活作用。而Wnt5a过表达，促进了粘着斑复合体通路蛋白（ITGB3和Paxillin）以及其下游关键酶（FAK和RhoA）的蛋白表达。其中ITGB3和RhoA蛋白与Wnt5a蛋白具有直接绑定相互作用。Wnt5a和粘着斑复合体在破骨细胞力学信号传递中具有协同作用。 【研究结论】 综上所述，本研究通过构建体内病理性骨硬度变化模型和体外人工细胞外基质硬度变化力学模型，从基因、蛋白和功能三个层面证实：细胞外基质硬度信号可以改变破骨细胞基本生物学行为，转录表达谱信息和骨基质吸收功能，对破骨细胞分化具有较强的调控作用。力学传递机制主要包含粘着斑复合体-细胞骨架信号轴和Wnt5a的协同作用。本研究从微环境生物力学信号的角度为骨骼疾病的发生发展和骨组织工程领域提供了新的理论基础。
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