摘要
研究背景：面神经损伤（facial nerve injury，FNI）多由颌面部创伤、医源性手术造成，若不干预最终可导致面瘫和毁容，严重影响患者的生活质量和心理健康。尽管目前显微外科技术的发展以及对神经再生的认识有了很大的进步，但神经修复治疗仍然不能保证面神经功能的完全恢复。在神经修复的复杂过程中，施旺细胞（Schwann cells，SCs）和巨噬细胞间的交互作用是不可或缺的一部分。如何通过调节这两种细胞间的交互作用以治疗 FNI，一直是该领域的研究热点。MicroRNAs（miRNAs）是一组短的、非编码的微小RNA序列，在神经系统中高度表达。其中，miRNA-22-3p（miR-22）已被证实是一种在神经突触中表达的特异性神经元相关的 miRNAs，因可促进神经元的再生而被认为在神经修复治疗中具有潜在的应用前景。但因miRNAs固有单链结构的不稳定性使其在临床上的应用极为受限。四面体框架核酸（tetrahedral framework nucleic acids，tFNAs) 是由四个单链DNA分子通过自组装而形成的新型纳米核酸材料。因具有良好的生物相容性、组织细胞渗透性和可编程性等诸多优点，使其成为将miRNAs递送至细胞内，提高miRNAs生物应用率的一种合适的治疗载体。而目前tFNAs 搭载 miRNAs 载药平台的开发及临床应用尚未得到充分的研究。 研究方法：本研究将miRNA-22-3p修饰到tFNAs载体结构上，构建了具有空间结构的纳米核酸复合物ctFNAs-miR22。以此作用于体内外面神经损伤模型，研究其促进损伤修复和轴突再生的能力。本研究将分成一下三个部分： 1、第一部分，基于四面体框架核酸的miR-22传递系统（ctFNAs-miRNA22）的构建：对合成tFNAs的其中一条单链DNA及 miR-22进行粘性末端的修饰，通过粘性末端的碱基互补配对构建 ctFNAs-miR22。8%凝胶电泳验证 ctFNAs-miRNA22的合成；纳米粒径电位仪检测ctFNAs-miRNA22粒径大小和Zeta电位；透射电镜及原子力显微镜观察ctFNAs-miRNA22的形态特征。采用不同浓度的血清检测ctFNAs-miRNA22的稳定性，并检测在4℃环境下储存一周后的稳定性。 2、第二部分，ctFNAs-miR22 对面神经损伤修复的体外研究：利用流式细胞术及细胞免疫荧光染色观察SCs及巨噬细胞对ctFNAs-miR22的摄取效率；采用CCK8检测ctFNAs-miR22对两种细胞活性的影响以筛选出该复合物的最佳浓度；使用EdU法检测ctFNAs-miR22对SCs的增殖影响；使用划痕及侵袭实验检测ctFNAs-miR22对SCs迁移的影响。使用蛋白印迹法检测SCs胞内对ATF-3、c-Jun、FGF-9、BDNF 以及上游信号 Erk/p-Erk 的蛋白表达，以及RAW264.7胞内对TNF-α、IL-10的蛋白表达；使用酶联免疫吸附试验（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测 RAW264.7 对 TNF-α、IL-10、IL-6细胞因子的分泌。将ctFNAs-miR22应用于SCs及RAW264.7共培养体系，利用划痕及侵袭实验检测 SCs 对RAW264.7的迁移影响；使用 ELISA检测共培养体系中细胞上清内CCL2、TNF-α、IL-10、FGF-9细胞因子的含量；使用蛋白印迹法检测共培养体系中 SCs 胞内对 c-Jun、Erk/p-Erk 的蛋白表达，以及RAW264.7胞内对iNOS、Nrf2、TNF-α、IL-10、p65/p-p65的蛋白表达。 3、第三部分，ctFNAs-miR22 对面神经损伤修复的体内研究：建立大鼠面神经损伤模型，通过触须运动评估 ctFNAs-miR22 对面神经功能恢复的影响；通过HE染色、甲苯胺蓝染色、透射电镜观察ctFNAs-miR22对面神经组织结构的影响；通过免疫组织化学染色检测髓鞘标记蛋白 MBP 的表达；用免疫荧光染色检测轴索标记蛋白 β-Ⅲ Tubulin、SCs 标记蛋白 S100、巨噬细胞标记蛋白CD68+、神经营养相关蛋白TrkB、BDNF的表达，以评估ctFNAs-miR22对面神经组织结构的影响。 研究结果： 1、8%凝胶电泳胶图显示了 ctFNAs-miR22 传递系统的成功合成且结构稳定性良好，透射电镜、原子力显微镜、纳米粒径电位仪检测到ctFNAs-miR22是一个带负电荷的三角锥形结构。 2、ctFNAs-miR22可增强SCs与巨噬细胞间的交互作用，通过发挥抗炎抗氧化作用，促进SCs对巨噬细胞的招募能力，并介导M2巨噬细胞的极化，进而调节微环境中细胞因子的表达，从而改善损伤后微环境；此外，它还通过加快启动SCs的胞内适应性修复程序，促进了SCs向修复型SCs表型的改变，为轴突再生提供条件。 3、ctFNAs-miR22可通过促进面神经损伤后SCs的重塑，增强SCs对轴突的包裹，促进轴突再生和SCs的再髓鞘化。此外，ctFNAs-miR22对面神经损伤后功能的恢复，可能与其上调 BDNF/TrkB 信号增强了神经肌肉连接的可塑性相关。 结论：综上所述，本课题成功构建了一种简单而高效的miR-22的传递系统ctFNAs-miR22，该系统可通过增强损伤后SCs与巨噬细胞的交互作用，改善损伤后微环境，促进面神经损伤后结构和功能修复。ctFNAs-miR22可能是一种具有光明前景的神经保护剂。
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