摘要
温度是影响微生物生长繁殖的关键因素，一些耐冷微生物在低温下仍能引起水产品腐败变质，造成巨大的经济损失。腐败希瓦氏菌具有较强的低温适应性，是冷藏海水鱼类的特定腐败菌。本文以腐败希瓦氏菌的一种关键应激因子——冷激蛋白为研究对象，通过PCR扩增获得了3个冷激蛋白基因序列，采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR对其理化性质、结构、功能特性和受低温诱导关键冷激蛋白进行了分析，构建了该关键冷激蛋白基因的缺失突变株，并对其生长、致腐和蛋白表达谱进行了比较分析，阐明了冷激蛋白在腐败希瓦氏菌不同温度培养下的作用及机制，旨在为进一步阐明腐败希瓦氏菌低温生长及致腐的机制提供参考，为该腐败菌的靶向抑制奠定基础。本文主要研究结果如下： 1. 腐败希瓦氏菌中的Csp1589、Csp1376和Csp2252均为典型的冷激蛋白，均为亲水的小分子酸性蛋白质，皆位于细胞质，为非分泌型、非跨膜蛋白，都存在冷激蛋白特有的冷休克结构域，存在DNA结合位点和RNA结合基序，能与单链DNA和单链RNA结合；腐败希瓦氏菌冷激蛋白Csp1589和Csp1376与大肠杆菌冷激蛋白CspA亲缘关系较近；蛋白的二级结构和三级结构均符合CSP家族的特征，包含5个反向平行的β折叠。三个冷激蛋白被预测在功能上分别与多种蛋白存在相互作用，包括参与双组分信号转导系统的组氨酸激酶，参与DNA复制的DNA聚合酶及伴侣蛋白htpG等；预测了CSP可能的配体结合位点；RT-PCR结果表明Csp1376是腐败希瓦氏菌受低温诱导的主要的冷激蛋白。为进一步分析冷激蛋白在腐败希瓦氏菌不同温度培养中的功能提供一定参考。 2. 利用同源重组的方法成功构建了腐败希瓦氏菌冷激蛋白Csp1376的缺失突变株，并探究了该基因缺失对不同温度条件下腐败希瓦氏菌生长的影响。结果表明， Csp1376缺失会抑制腐败希瓦氏菌在28℃的生长。低温胁迫及Csp1376的缺失皆能抑制腐败希瓦氏菌的泳动能力，但对腐败希瓦氏菌细胞形态的影响较小。温盐胁迫结果表明Csp1376的缺失显著降低了腐败希瓦氏菌对盐度胁迫的耐受性，且4℃时这种表现更加明显。流式细胞仪结果表明Csp1376的缺失突变株在培养24 h和48 h后的细胞凋亡率皆高于野生株，其在营养缺失时的生存能力降低。结果表明Csp1376的缺失对不同温度下腐败希瓦氏菌的生长能力产生重要影响。尽管Csp1376不是28℃下高表达的冷激蛋白，但仍在腐败希瓦氏菌28℃生长过程中起到重要作用。 3. 以腐败希瓦氏菌野生株和突变株为研究对象，探究了不同温度条件下Csp1376基因缺失对腐败希瓦氏菌腐败能力的影响。Csp1376的缺失会降低腐败希瓦氏菌在28℃、4℃的生物被膜生成量，及4℃时胞外聚合物的数量和种类。野生株和突变株在4℃条件下均未检测到H2S生成，然而，在28℃条件下，Csp1376的缺失降低了腐败希瓦氏菌的产硫能力，增加了菌体对外源群体感应信号分子的利用率。此外， Csp1376负调控胞外蛋白酶的产生，但低温条件下突变株的的胞外蛋白酶的生成能力反而低于野生株。结果表明Csp1376的缺失对不同温度下腐败希瓦氏菌的致腐能力产生影响，是腐败希瓦氏菌中的重要调控因子。 4. 对腐败希瓦氏菌野生株和突变株在不同温度条件下的蛋白质组进行了比较分析。结果表明，野生株和突变株在4℃相较于28℃时分别表达86、53种差异蛋白， 28℃和4℃培养时突变株相较于野生株分别表达101、96种差异蛋白。野生株和突变株在4℃相较于28℃的差异表达蛋白以上调蛋白为主，28℃和4℃培养时突变株相较于野生株的差异表达蛋白以下调蛋白为主。GO及KEGG富集分析表明低温诱导野生株下调的蛋白主要涉及糖酵解/糖异生、无氧呼吸、氨基酸代谢、铁硫簇结合等生理代谢过程，而诱导上调表达蛋白主要包括蛋白合成分泌及转运、蛋白质四聚体化、细胞质膜及细胞外膜相关蛋白等；Csp1376缺失引起腐败希瓦氏菌下调了大量蛋白，主要涉及糖酵解、三羧酸循环、葡萄糖代谢等代谢途径，翻译、折叠、核糖体通路等蛋白合成相关途径，以及RNA降解、氨酰基-tRNA生物合成等RNA代谢途径。研究结果筛选了参与腐败希瓦氏菌低温适应的相关蛋白和通路、冷激蛋白Csp1376可能调控的相关蛋白及通路，揭示了冷激蛋白Csp1376在腐败希瓦氏菌不同温度下的作用机制。
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