摘要
1. 研究背景 KLF4（Krüppel-like factor 4）是一种具有调节细胞生长、增殖、分化等多种细胞过程功能的进化保守型含锌指转录因子。KLF4功能障碍已在许多人类疾病中被观察到，特别是在癌症中，由于其具有癌基因和抑癌基因的双重性质，因此得到人们广泛关注。这种矛盾性质暗示KLF4在人类恶性肿瘤中的重要作用，并强调进一步探索KLF4在肿瘤发生中功能和潜在分子机制的必要性。 黑色素瘤是一种起源于神经脊的黑素细胞上皮性恶性肿瘤，是黑素细胞痣的一种恶性变化。传统治疗黑色素瘤的方法有手术、放疗、化疗等，但这些治疗方法都没有令人满意的效果。尽管最近治疗方法有所改善，但黑色素瘤晚期依然难以根治。因此黑色素瘤发生机制和相应临床治疗方案都是迫切需要解决的问题。 鸦胆子苦醇，是我国常用治疗癌症的传统草药，可以增强化疗药物的抗肿瘤效果，抑制癌细胞的发生发展。此外，鸦胆子苦醇也被证明通过多种信号通路影响肿瘤的发展进程。但它在黑色素瘤中的作用和潜在机理的报道却很少。因此，我们想通过探索KLF4对鸦胆子苦醇治疗黑色素瘤的影响，为鸦胆子苦醇治疗黑色素瘤提供新的治疗靶点。 2. 研究目的 基于本实验室先前的研究结果，结合生物学相关实验探讨鸦胆子苦醇对黑色素瘤中KLF4表达的影响，揭示KLF4干预鸦胆子苦醇治疗黑色素瘤功能的分子机制，提供癌症治疗的新靶点。 3. 研究方法 (1) 鸦胆子苦醇处理黑色素瘤细胞系，Western blot检测细胞中KLF4表达情况。 (2) 鸦胆子苦醇处理敲低和过表达KLF4黑色素瘤细胞系，Western blot检测细胞中PARP及切割PARP的表达情况，采用流式细胞仪检测细胞凋亡，采用 Edu 细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖。 (3) 将敲低KLF4黑色素瘤细胞系通过皮下注射异种移植到小鼠体内，并将鸦胆子苦醇进行灌胃给药处理，分析小鼠体内细胞成瘤情况。免疫组化检测敲低KLF4影响鸦胆子苦醇干预成瘤血管形成、细胞增殖和凋亡情况。 (4) RNA测序寻找KLF4和鸦胆子苦醇下游调控基因NCK2，荧光定量PCR分别检测KLF4敲低和鸦胆子苦醇处理后黑色素瘤细胞系中NCK2 mRNA表达水平，Western blot和荧光定量PCR分别检测KLF4敲低和过表达黑色素瘤细胞系中NCK2蛋白和mRNA表达水平。 (5) Western blot和荧光定量PCR分别检测过表达KLF4是否干预鸦胆子苦醇诱导黑色素瘤细胞系NCK2蛋白和mRNA表达水平变化。 (6) 荧光素酶报告实验检测不同条件下黑色素瘤细胞系中荧光素酶活性，明确KLF4在NCK2启动子上的结合位点，通过染色质免疫沉淀实验检测KLF4与NCK2启动子的结合。 4. 研究结果 (1) Western blot结果显示鸦胆子苦醇诱导黑色素瘤细胞系中KLF4蛋白水平表达下调。 (2) Western blot结果和流式细胞仪分析显示敲低KLF4促进鸦胆子苦醇诱导的黑色素瘤细胞系凋亡，反之则抑制凋亡。Edu细胞增殖检测结果显示过表达KLF4逆转鸦胆子苦醇诱导的黑色素瘤细胞系增殖下降。 (3) 小鼠体内成瘤实验结果显示敲低KLF4促进鸦胆子苦醇对黑色素瘤的干预效果和抗肿瘤能力，免疫组化结果显示敲低KLF4促进鸦胆子苦醇诱导Ki67、CD31下降，Cleaved Caspase 3增加。 (4) 测序发现KLF4与鸦胆子苦醇共同调控NCK2表达，荧光定量PCR验证黑色素瘤细胞系分别经KLF4敲低和鸦胆子苦醇处理后NCK2 mRNA表达下降。 (5) Western blot和荧光定量PCR结果显示敲低KLF4黑色素瘤细胞系中NCK2蛋白和mRNA表达水平下降，反之则上升。Western blot和荧光定量实验结果显示鸦胆子苦醇诱导黑色素瘤细胞系中NCK2蛋白和mRNA表达水平下降，过表达KLF4逆转这种下降。 (6) 染色质免疫沉淀和荧光素酶报告实验结果表明KLF4和NCK2启动子存在阳性结合位点。 5. 研究结论 (1) 鸦胆子苦醇诱导黑色素瘤中KLF4表达下调。 (2) KLF4参与鸦胆子苦醇诱导的黑色素瘤细胞凋亡和增殖，敲低KLF4促进鸦胆子苦醇对黑色素瘤的干预效果和抗肿瘤能力。 (3) KLF4和鸦胆子苦醇共同调控NCK2的表达，鸦胆子苦醇诱导NCK2下调，而过表达KLF4抑制鸦胆子苦醇诱导的NCK2下调。 (4) KLF4通过转录调控的方式影响NCK2的表达且在NCK2启动子（-500至-250）区域存在一个阳性结合位点。
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