UQCRC1在胶质母细胞瘤恶性表型及替莫唑胺耐药中的作用机制研究

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中文摘要：研究背景：多形性胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme,GBM）是最为普遍的原发性颅内肿瘤，具有极高的恶性程度，由多形性胶质母细胞组成，具有高度侵袭性、易复发、生存预后差等特点。手术切除、辅以放疗和化疗的综合治疗是目前GBM最常见的治疗方案。其中替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）作为一线标准化疗药物，在 GBM 的临床治疗方面取得了巨大进步。尽管 TMZ的应用有效地延长了患者的生存期，改善了患者的生存质量，但 GBM高度的侵袭性和分子异质性，导致大部分患者经 TMZ治疗后出现不同程度的耐药，这种化疗抵抗造成的治疗失败被认为是导致GBM患者疾病进展和复发的主要原因之一。尽管目前研究发现了多种导致GBM对TMZ耐药的因素，但TMZ耐药的确切机制仍不明确。因此，探索 GBM 对 TMZ 耐药的新机制，寻找能够克服TMZ 耐药的新靶点和策略，对于提高 GBM 患者的治疗效果，改善患者的生存具有重要意义。本课题拟利用LC-MS/MS质谱技术对3例原发性GBM组织和3例复发性GBM组织进行蛋白质组分析，筛选并鉴定出与GBM复发耐药相关的差异蛋白，并探究其在GBM 细胞恶性增殖和化疗抵抗中的影响及作用机制，以期为解析和克服 GBM 化疗抵抗提供新的理论依据和方向。方法： 1、GBM相关差异蛋白的筛选和鉴定：对GBM原发和复发组织各取3例进行质谱定量，结合生物信息学分析，在GBM复发组织中筛选出差异表达且与患者预后相关的蛋白，通过 Western blot、免疫组化验证其在组织中的表达。 2、探究目标蛋白 UQCRC1 促进 GBM 细胞恶性增殖的作用：通过 qRT-PCR 和Western blot 验证 UQCRC1 在 GBM 细胞系（U251、T98G、SHG44、A172）和正常星形胶质细胞（HA）中的表达水平；利用基因编辑技术分别沉默和过表达UQCRC1,通过CCK8、划痕、Transwell、平板克隆及流式细胞术检测目标蛋白UQCRC1表达水平改变后对GBM细胞恶性生物学行为的影响。 3、UQCRC1影响GBM细胞TMZ耐药的机制探究：构建GBM细胞TMZ耐药株（U251-TR和SHG44-TR），利用CCK8检测耐药株的IC50值及耐药倍数,验证UQCRC1在 GBM 敏感细胞和耐药细胞株中的表达；通过改变 UQCRC1 的表达水平，检测其对胶质瘤细胞 TMZ 耐药性的影响；通过检测 ROS、ATP 的表达含量和 Western blot 检测氧化磷酸化和糖酵解相关蛋白的表达水平，验证 UQCRC1 对线粒体氧化磷酸化和对下游信号通路AMPK/mTOR的影响。结果： 1、通过质谱结合生物信息学分析，共定量到5037个蛋白，其中原发性GBM组织中定量到4456个蛋白，复发性GBM组织中定量到 4033个蛋白。相较于原发性 GBM组织，GBM复发组织中上调的蛋白有311个，下调的为134个。分析TCGA数据库中的测序数据，结果表明在GBM复发组织中UQCRC1呈高表达且与患者不良预后相关。Western blot和免疫组化证实 UQCRC1在复发性 GBM组织中表达上调。Gene Ontology和KEGG富集分析发现UQCRC1等差异表达基因主要集中在氧化磷酸化、线粒体电子传递和细胞呼吸等通路中。 2、UQCRC1沉默抑制了 GBM细胞的增殖，迁移侵袭和克隆形成，促进 GBM细胞的凋亡；而过表达 UQCRC1 则促进 GBM 细胞增殖，迁移、侵袭及克隆形成能力，并抑制了细胞的凋亡。 3、UQCRC1的表达随TMZ浓度的增加而上调，在TMZ耐药细胞株中的表达水平显著高于亲本细胞，能够促进胶质瘤细胞TMZ耐药性；UQCRC1的过表达能部分抵消TMZ造成的细胞生长抑制，其可能通过激活AMPK/mTOR信号通路，增强GBM细胞线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和 ATP的生成，从而促进 GBM细胞恶性增殖和 TMZ耐药性。结论：本研究发现线粒体相关蛋白UQCRC1在复发性GBM组织和TMZ耐药的GBM细胞中表达上调，首次研究了其在 GBM中的细胞生物学功能和对 TMZ耐药机制的影响，初步实验结果表明UQCRC1可能通过激活AMPK/mTOR信号通路来增强线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和ATP的生成，最终促进GBM细胞的恶性增殖和化疗抵抗。

作者：

马吉英

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关键词：

多形性胶质母细胞瘤替莫唑胺 UQCRC1蛋白恶性表型耐药性

授予学位：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

陈超、王会娟

学位年度：

2023

学位授予单位：

西北大学

语种：

中文

中图分类号：

R73