摘要
益生菌是一类能够调节宿主肠道微生态平衡，并产生有益效果的微生物。在实际应用过程中，各种不利条件和环境突变经常会对益生菌的生长和代谢产生消极影响，益生功能的发挥也会受到抑制。本研究以前期筛选的益生菌菌株植物乳杆菌CGMCC8198为研究对象，分别从分子改造，适应性驯化和微胶囊化三个方面探究其在高温胁迫下的保护机制，从而提高其抵抗高温胁迫的能力。具体内容如下： 本研究利用转录组学技术研究及解析植物乳杆菌CGMCC8198的生长代谢机制及应激机理，挖掘与高温胁迫相关的功能基因，并通过原核表达验证相关基因的作用。对高温转录组数据分析得到110个显著差异表达的基因，并从中选取10个进行RT-PCR验证，证明测序结果可信。通过生物信息学方法从中筛选出的4个潜在功能基因：磷酸核糖-ATP 焦磷酸酶 hisE (CGMCC_2299)、醇脱氢酶 adhE-like (CGMCC_0725)、黄素氧还蛋白 ykuN (CGMCC_1248)和二氢喋呤醛缩酶 folB (CGMCC_2936)并进行理化性质等的分析，然后以它们为目的基因构建原核表达系统。以空载体菌株为对照，对重组菌的生长曲线分析发现，重组蛋白的诱导表达在37℃和42℃都对菌株生长有促进作用；膜表面疏水性分析表明，重组蛋白对菌株在50℃下的膜表面疏水性具有稳定作用。以50℃处理30 min后发现，重组菌的活菌数及存活率都高于对照组，尤其是菌株E. coli pET28a-ykuN。此外膜完整性分析表明，温度处理后膜完整的菌体比例分别为91.5%、93.7%、85.1%和76.3%，都显著高于对照的54.6%。本研究筛选出的功能基因在过表达之后都能提高菌株抵御高温胁迫能力，使菌株的存活率提升。 研究通过适应性驯化，筛选出一株高温耐受能力相对较强的菌株。经50℃处理10 min后，存活率为0.925%。在此基础分别延长时间至30 min和1 h和升高温度为60℃和70℃后，存活率都明显高于原始菌株对应的存活率。在高温处理后，对驯化菌株的功能基因表达分析，前期筛得的四个功能基因表达水平都高于其在原始菌株中的表达水平，进一步证明这四个功能基因表达上调能够增强植物乳杆菌CGMCC8198的高温耐受性。 益生菌微胶囊制备技术可以保证益生菌对不良环境具有一定的抵抗能力，提高益生菌的存活率。对植物乳杆菌CGMCC8198微胶囊的制备工艺进行优化，以壁材添加木薯淀粉质量分数、大豆分离蛋白质量分数、固化液CaCl2的质量分数和芯壁比为单因素确定其对微胶囊包埋率均有显著影响。然后通过响应面实验确定各因素最佳方案分别为6.51%、7.5%、2.61%和1∶2.42，并验证最优包埋率为91.38%。通过扫描电镜对微胶囊形态观察发现，微胶囊能够对菌体完全包裹，起到很好的保护作用，且喷雾干燥后的粒径更小约在20μm左右。高温耐受性试验表明微胶囊在不同高温处理30 min后的活菌数都显著高于对照组，且模拟人工胃液和肠液试验表明微胶囊具有优良的耐酸性和较好的肠溶性，能够满足在人体定植的条件。在4℃条件下对微胶囊进行储存30 d后，活菌数保持在94.45%以上，利于储藏。同时壁材能够提高经包埋菌株中功能基因adhE-like和ykuN在50℃处理30 min后的表达水平，增强微囊保护效果。
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