摘要
蛋氨酸是动物的必需氨基酸，蛋氨酸缺乏会导致动物组织损伤和细胞死亡。目前，常见的死亡方式包括细胞凋亡、自噬、细胞焦亡、坏死性凋亡等。然而，关于蛋氨酸对细胞死亡影响的研究鲜有报道。因此，本文旨在探究蛋氨酸对草鱼原代肝细胞死亡的影响。 试验一蛋氨酸对草鱼原代肝细胞活性的影响 首先，采用胰蛋白酶消化法分离培养草鱼原代肝细胞，在不同时间采集样品。结果发现，刚分离培养的肝细胞呈圆形，细胞核位于细胞正中，细胞边界轮廓清晰，含有肝腺泡。随后几个细胞连接在一起开始成片生长，直至细胞膜融合，符合肝细胞形态的典型特征。且细胞活性和白蛋白（ALB）含量均在培养 76和 96 h 时达到最大值（P ＜ 0.05）。表明，草鱼原代肝细胞体外模型鉴定成功。其次，用蛋氨酸（0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L）处理细胞不同时间后采集样品。结果发现，1 mmol/L蛋氨酸处理细胞 48 h 后，细胞活性、ALB 含量及乳酸脱氢酶（LDH）活性均达到最佳值（P ＜ 0.05）。表明，蛋氨酸处理细胞的最佳浓度是 1 mmol/L。 试验二蛋氨酸对草鱼原代肝细胞焦亡的影响 首先，用 0 或 1 mmol/L 蛋氨酸处理细胞 48 h 后采集样品。结果发现，蛋氨酸缺乏组细胞膜破裂，细胞核皱缩、染色质裂碎，核仁消失，出现类似自噬体的结构，而1 mmol/L 蛋氨酸组细胞形态良好。此外，添加蛋氨酸显著降低 LC3 Ⅱ、Bax，增加Bcl-2、P62、IL-1β、caspase-1、RIP1、RIP3 的基因或蛋白表达（P ＜ 0.05）。表明，添加蛋氨酸可能缓解细胞凋亡、自噬；但加剧细胞焦亡、坏死性凋亡。其次，分别用 100 ng/mL 脂多糖（LPS）和尼日利亚菌素钠盐（Nig）（0.0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 μmol/L）处理细胞不同时间后采集样品。结果发现，LPS 处理细胞 4 h 后用0.5 μmol/L Nig 处理0.5 h，导致细胞膜破裂、细胞存活率约为 80%，PI阳性细胞比例约为20%，且NLRP3、ASC、caspase-1、GSDME、IL-1β的基因或蛋白表达均显著增加（P ＜ 0.05）。表明，草鱼原代肝细胞焦亡模型构建成功。最后，在细胞焦亡模型基础上用 0 或 1 mmol/L 蛋氨酸处理细胞 48 h 后采集样品。结果发现，添加蛋氨酸对细胞活性无显著影响（P ＞ 0.05）；但显著增加 NLRP3、ASC、caspase-1、GSDME、IL-1β 的基因或蛋白表达量（P ＜ 0.05）。表明，添加蛋氨酸可能加剧细胞焦亡的发生。 试验三蛋氨酸对草鱼原代肝细胞自噬的影响 首先，用自噬抑制剂氯喹（CQ）（0、5、10、20、40 μmol/L）和蛋氨酸（0、1 mmol/L）共处理细胞48 h，再用 LPS/Nig 引发焦亡后采集样品。结果发现，使用20 μmol/L CQ 处理细胞显著增加蛋氨酸缺乏时细胞中 NLRP3、caspase-1、IL-1β 的蛋白表达（P ＜ 0.05）；而在添加蛋氨酸时无显著影响（P ＞ 0.05）。表明，添加蛋氨酸时，自噬的发生可能抑制了细胞焦亡。其次，用 AMPK 抑制剂化合物 C（CC） （0、2、4、8、16 μmol/L）和蛋氨酸（0、1 mmol/L）共处理细胞 48 h 后采集样品。结果发现，添加蛋氨酸显著降低细胞中LKB1、AMPK、ULK1的基因和蛋白表达（P ＜ 0.05），而对 TOR 的基因和蛋白表达无显著影响（P ＞ 0.05）。使用 16 μmol/L CC 处理细胞显著降低了蛋氨酸缺乏时细胞中 LC3 Ⅱ、增加了 P62 的蛋白表达（P ＜ 0.05）；而在添加蛋氨酸时未对 P62 的蛋白表达产生影响 (P ＞ 0.05)，但进一步降低了细胞中LC3 Ⅱ的蛋白表达（P ＜ 0.05）。表明，添加蛋氨酸时，AMPK 信号通路被抑制，进而缓解了细胞自噬。最后，用不同浓度活性氧（ROS）清除剂（NAC） （0.0、2.5、5.0、7.5 mmol/L）预处理细胞 1 h，再用蛋氨酸（0、1 mmol/L）处理细胞 48 h 后采集样品。结果发现，添加蛋氨酸显著增加谷胱甘肽（GSH）含量、降低 ROS 含量，且在细胞焦亡模型下添加蛋氨酸进一步降低了 ROS 含量（P ＜0.05）。使用 5 mmol/L NAC 预处理细胞显著降低了蛋氨酸缺乏时细胞中 AMPK 的蛋白表达（P ＜ 0.05）；而添加蛋氨酸时未对细胞中 AMPK 的蛋白表达产生影响（P ＞0.05）。表明，添加蛋氨酸时，ROS产生被阻断，进而抑制了AMPK信号通路激活。 综上所述，添加蛋氨酸可能通过抑制ROS-AMPK信号通路激活缓解草鱼原代肝细胞细胞自噬并加剧细胞焦亡。
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