摘要
雌激素（Estrogen）作为一种重要的内分泌激素，在动物繁殖调控中起着至关重要的作用，如促进雌性动物发情、排卵等。大豆异黄酮（Soy isoflavone，SIF）是一种从大豆中提取的生物活性物质，具有与雌激素相似的结构和弱雌激素样活性。此外，SIF多羟基结构赋予了其较强抗氧化能力。目前关于SIF在畜禽上的应用研究较多，但有关其对妊娠母猪繁殖性能的影响及其对早期胚胎发育的调控机制却鲜有报道。本研究首先考察了 SIF 对经产母猪繁殖性能和抗氧化能力的调节作用。在此基础上，利用多组学技术探究了 SIF 对羊水代谢物组成、卵巢和胎盘功能状态的影响，以揭示 SIF 改善胎儿生长发育的机理，并进一步通过建立猪胎盘滋养层细胞体外氧化应激模型，考察了 SIF 对胎盘滋养层细胞氧化损伤的保护作用，解析其相关信号通路及关键调控靶点。该研究不仅为 SIF 在妊娠母猪生产中的合理应用提供了理论参考，还为进一步探寻提高妊娠母猪繁殖性能的有效调控措施提供了新的思路。 试验一饲粮添加 SIF对妊娠母猪繁殖性能和抗氧化能力的影响 试验选用 120 头经产母猪（长白×大白二元杂交母猪），随机分为 2 组（n = 60），即对照组和试验组，在妊娠期间分别饲喂基础饲粮和含有 200 mg/kg SIF 的试验饲粮。结果表明：与对照组相比，SIF 显著提高妊娠母猪窝总产仔数、窝产活仔数以及窝产活仔体重（P ＜ 0.05），并显著缩短妊娠母猪产程（P ＜ 0.05）；SIF提高妊娠期第 35 d母猪血清雌二醇和孕酮浓度（P ＜ 0.05），显著提高血清总抗氧化能力（T-AOC），超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性以及免疫球蛋白 IgG浓度（P ＜ 0.05），显著降低甘油三酯浓度（P ＜ 0.05）；SIF显著提高妊娠第 85 d 妊娠母猪血清 T-AOC和 SOD活性（P ＜ 0.05）；与对照组相比，SIF 显著提高妊娠母猪分娩时脐带血胰岛素和胰岛素生长因子 1（IGF-1）浓度，显著降低脐带血中丙二醛（MDA）含量（P ＜ 0.05）。饲粮添加 SIF降低了胎猪脐带血中十七烯酸甘油三酯含量（P ＜ 0.05），但可显著提高脐带血中二十碳五烯酸（P ＜ 0.05），以及赖氨酸（Lys）、牛磺酸（Tau）、甘氨酸（Gly）和鸟氨酸（Orn）含量（P ＜ 0.05）；与对照组相比，SIF 显著提高妊娠母猪胎盘钠耦合中性氨基酸转运蛋白（SNAT1）和 IGF-1 基因表达水平（P ＜ 0.05）。上述结果表明， SIF 可通过调节妊娠母猪血清激素水平、提高抗氧化能力和上调胎盘关键功能基因表达水平等改善经产母猪繁殖性能。 试验二饲粮添加 SIF对妊娠母猪早期胚胎发育及羊水代谢物组成的影响 试验一结果表明，SIF 能够改善妊娠母猪繁殖性能。然而，这一效应是否与其改善早期胎儿生长发育有关却鲜有报道。本试验旨在考察母猪妊娠期饲粮添加SIF对妊娠母猪早期胚胎发育、羊水激素水平及代谢产物的影响。试验选用 12头经产母猪（长白×大白二元杂交母猪），随机分为2组，即试验组与对照组（n = 6），分别饲喂基础饲粮和含有 200 mg/kg SIF 试验饲粮。母猪于妊娠第 35 d 屠宰取胚胎、羊水及组织样，利用1H核磁共振代谢组学技术分析羊水代谢物组成。结果表明：SIF 显著提高妊娠第 35 d 母猪子宫重、总胚胎数、可存活胚胎数以及可存活胚胎平均窝重，显著降低产木乃伊数（P ＜ 0.05）；SIF 显著提高妊娠第 35 d 母猪血清孕激素（P）浓度和GSH-Px活性（P ＜ 0.05），以及羊水中雌激素（E）、P和IGF-1浓度（P ＜ 0.05）；此外，SIF显著提高羊水中免疫球蛋白M（IgM）和GSH-Px含量（P ＜ 0.05），并降低羊水肿瘤坏死因子（TNF-α）浓度（P ＜ 0.05）；SIF显著上调胚胎背最长肌中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）表达水平，降低真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 1（4E-BP1）表达水平（P ＜ 0.05）。利用 1H 核磁共振代谢组学分析定量羊水中30多种化合物，其中，部分关键代谢物，如绝大多数氨基酸、葡萄糖、肌酸和柠檬酸在补充 SIF 后显著升高（P ＜ 0.05）。进一步分析表明，受SIF影响的代谢途径包括D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、氨基酰-tRNA生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等。上述结果表明，SIF可通过改善母体羊水中激素水平、抗氧化能力和氨基酸代谢等促进早期胚胎发育，进而改善妊娠母猪繁殖性能。 试验三饲粮添加 SIF对妊娠母猪卵巢功能的影响 卵巢是母猪最重要的繁殖器官，本试验通过 RNA-seq技术探讨饲粮添加 SIF对妊娠母猪卵巢转录组的影响，以进一步揭示 SIF 改善妊娠母猪繁殖性能的相关机理。试验设计同试验二。结果表明：饲粮添加 SIF 对妊娠母猪卵巢重量、黄体数量等无影响，但显著降低妊娠母猪卵巢组织中 IL-1β 和 IL-6 含量（P ＜ 0.05）；SIF显著增加卵巢组织中 T-AOC和 CAT的活性，并降低 MDA含量（P ＜ 0.05）；RNA-Seq结果表明，饲粮添加SIF后卵巢组织中有显著差异表达的基因（DEGs）共有 237个，其中有 90个基因上调，147个基因下调；GO分析表明，这些差异表达基因富集免疫系统过程（GO:0002376）、免疫反应（GO:0006955）、白细胞激活（GO:0006955）、细胞表面受体信号通路（GO:0007166）、MHC 蛋白复合物（GO:0042611）、氧化还原酶（GO:0016651）等生物学过程；KEGG 分析结果则发现，237个DEGs主要富集于31条信号途径，包括吞噬体信号通路（ko04145）、类风湿性关节炎信号通路（ko05323）、肺结核信号通路（ko05152）、细胞黏附分子信号通路（ko04514）、细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路（ko04060）等免疫调节相关信号通路；RT-PCR 结果进一步证实，SIF 显著下降卵巢组织中CD86、SLA-DMB、TLR4、SLA-DQB1、NLRP3等基因表达水平（P ＜ 0.05），上调GCLC、NQO1、FOXO1、PPARG 等基因表达水平（P ＜ 0.05），与转录组结果一致；Western Blot（WB）结果表明，SIF显著提高卵巢组织中抗氧化信号途径关键调节分子核因子 E2 相关因子 2（NRF2）、醌氧化还原酶（NQO1）、血红素氧合酶-1 （HO-1）等蛋白表达水平（P ＜ 0.05），显著降低卵巢 Toll样受体 4（TLR-4）、磷酸化 AKT/AKT（p-AKT/AKT）、磷酸化 NFκB/NFκB（p-NFκB/NFκB）和磷酸化IκBα/IκBα（p-IκBα/IκBα）等炎症反应相关蛋白表达水平（P ＜ 0.05）。上述结果表明，SIF可通过激活NRF2/HO-1信号途径并上调NQO1表达水平，进而增强妊娠母猪卵巢组织抗氧化能力；此外，SIF可显著抑制NF-κB/IκB信号途径，进而缓解卵巢炎性损伤，改善其功能。 试验四饲粮添加 SIF对妊娠母猪胎盘转录组的影响 胎盘是实现母体与胚胎之间营养物质交换的重要媒介，本试验通过Hamp;E染色和RNA-seq技术探讨饲粮添加SIF对妊娠母猪胎盘功能和相关信号通路的影响。试验设计同试验二。结果表明：饲粮添加 SIF 明显提高妊娠早期母猪胎盘血管密度，血管明显扩张，未见淤血、坏死等变化，而对照组胎盘血管腔相对狭窄；RNA-seq鉴定到有显著差异的基因（DEGs）共有989个，其中SIF组有864个基因表达上调，125个基因表达水平下调；GO分析结果显示，这些DEGs主要富集于氧化还原过程（GO:0055114）、跨膜转运（GO:0055085）、蛋白质水解（GO:0006508）、离子转运（GO:0006811）、磷酸化作用（GO:0016310）、蛋白质结合（GO:0005515）、信号受体结合（GO:0005102）等条目；KEGG 分析结果表明，DEGs 主要涉及 PI3K-AKT 信号通路（ko04151）、cGMP-PKG 信号通路（ko04022）、Wnt信号通路（ko04310）、Hippo信号通路（ko04390）、HIF-1信号通路（ko04066）、JAK-STAT 信号通路（ko04630）、类固醇激素生物合成（ko00140）等与胎盘发育相关信号通路；采用 qPCR方法对随机挑选的 10个表达基因进行验证，结果与转录组分析一致。上述结果表明，饲粮添加 SIF 能够促进胚胎生长发育的机制可能与其调节胎盘PI3K-AKT、JAK-STAT等信号通路关键分子表达、以及促进胎盘类固醇激素生物合成等改善胎盘发育与功能有关。 试验五 SIF对猪胎盘滋养层细胞氧化损伤的保护效应与机制 试验二和试验三结果表明，SIF 可显著改善妊娠母猪子宫和卵巢的抗氧化状态。试验四发现饲粮添加 SIF能够促进胎盘组织 PI3K-AKT和 JAK-STAT等抗氧化途径关键调节分子表达，但 SIF 是否调控该信号通路进而缓解胎盘组织的氧化损伤，尚未见报道。本试验通过H2O2构建猪胎盘滋养层细胞氧化损伤模型，进一步探究 SIF对 PI3K-AKT和 JAK-STAT等信号通路的调节作用，以揭示其缓解胎盘氧化损伤的机制。结果表明：0.15 mM H2O2处理胎盘滋养层细胞显著降低其细胞活力、抗凋亡分子（Bcl-2）表达水平和抗氧化酶活性（SOD 和 GSH-Px）（P ＜0.05），显著增加 G0期的细胞比例、总凋亡率以及促凋亡分子（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9）表达水平和 MDA含量；与 H2O2处理组相比，1μΜ SIF和H2O2共处理胎盘滋养层细胞后，细胞活力得到显著改善，且 G0期比例、总凋亡率、凋亡分子（Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9）表达水平以及 MDA含量均显著降低（P ＜ 0.05）；此外，SIF 处理能够提高 PI3K-AKT、Hippo、cGMP-PKG、JAK-STAT等细胞增殖相关信号通路及其下游基因表达；此外，SIF能够显著提高H2O2诱导的胎盘滋养层细胞中p-JAK2和p-STAT3相对蛋白表达水平（P ＜ 0.05）。上述结果表明，H2O2可致胎盘滋养层细胞氧化损伤，表现在细胞活力下降，细胞增殖相关信号异常以及细胞增殖能力下降，而 SIF可通过 JAK-STAT信号途径缓解H2O2诱导的胎盘滋养层细胞氧化损伤。 综上所述，饲粮添加SIF可通过提高妊娠母猪体内激素水平（如P和E浓度）和机体抗氧化酶（GSH-Px 和 SOD）活性，并促进胎盘养分转运基因（SNAT1 和IGF-1）表达改善早期胚胎发育，进而提高妊娠母猪繁殖性能。此外，SIF 可通过PI3K-AKT和JAK-STAT信号通路介导NRF2和Bcl-2活化，促进抗氧化和抗调亡基因的表达，并抑制 NF-κB/IκB 信号途径激活，降低炎症因子的产生，缓解卵巢和胎盘氧化损伤。该研究不仅为 SIF 在妊娠母猪生产中的合理应用提供了理论参考，还为进一步探寻提高妊娠母猪繁殖性能的有效调控措施提供了新的思路。
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