摘要
目的 研究莲心碱（Liensinine, C37H42N2O6）抗高血压、保护血管功能的药效作用，并进一步探讨莲心碱对 Ca2+信号、NF-κB 信号、MAPK 信号、TGF-β/Smads 信号的影响，以及对 AT1R 胞内转运的调控作用，明确调控 Rab5a 影响 AT1R内吞是莲心碱抑制高血压及保护血管功能的新机制。以期为莲心碱临床防治高血压提供理论依据，为高血压的发病机制研究寻找新靶点提供思路。 方法 1、莲心碱抗高血压、保护血管功能的药效作用：通过皮下渗透泵对 C57BL/6 小鼠给予Ang Ⅱ诱导，构建小鼠高血压模型。分组情况为假手术组（Control组）、Ang Ⅱ模型组（Ang Ⅱ组）、阳性药治疗组[Ang Ⅱ+缬沙坦Val（10.4 mg/kg）]、莲心碱低剂量组[Ang Ⅱ+Lien（2.5 mg/kg）]、莲心碱中剂量组[Ang Ⅱ+Lien（5 mg/kg）]、莲心碱高剂量组[Ang Ⅱ+Lien（10 mg/kg）]，每组均为 12 只小鼠采用无创血压仪、小动物超声、HE 染色等技术，检测小鼠血压，腹主动脉脉冲波传播速度和形态学改变；血管张力检测系统检测莲心碱对Ang Ⅱ引起离体腹主动脉血管张力增加的影响；采用 ELISA 及免疫组化观察莲心碱对高血压体循环及血管组织中炎症反应的干预作用；通过天狼星红染色及免疫组化检测莲心碱对高血压引起的血管重构的作用。 2、莲心碱保护血管功能的药效机制研究：通过 Western Blot 及免疫组化，在体内外高血压模型和血管平滑肌细胞系中探讨 Ang Ⅱ对 Ca2+信号、 NF-κB 信号、 MAPK 信号、 TGF-β/Smads 信号引起的血管收缩、血管炎症及血管重构的影响及莲心碱的干预作用。并首次通过内吞抑制剂和莲心碱联用观察其对血管张力的影响。 3、AT1R内吞关键分子Rab5a调控高血压的作用及分子机制：采用ES打靶的方式构建 Rab5a敲除（Knock Out, KO）小鼠；尾静脉注射腺相关病毒的方式构建 Rab5a过表达（Over Expression, OV）小鼠。通过 Ang Ⅱ诱导 Rab5a KO及 Rab5a OV小鼠，构建小鼠高血压模型。采用无创血压仪，小动物超声和HE染色等监测高血压小鼠的血压，腹主动脉脉冲波传播速度和形态学改变。通过小干扰RNA构建Rab5a敲减的细胞模型，采用激光共聚焦显微镜系统等技术观察siRab5a对AT1R内吞及胞内转运的影响。 4、莲心碱对 Rab5a表达及 AT1R胞内转运的调控作用：首先通过 QPCR技术研究莲心碱干预对血管平滑肌细胞中 Rab5a 转录水平的影响，其次通过莲心碱分别联用合成酶抑制剂与溶酶体降解抑制剂探讨莲心碱对 Rab5a 蛋白合成的影响，最后使用激光共聚焦显微镜观察 Ang Ⅱ对 AT1R 内吞的激活作用及莲心碱干预对 Ang Ⅱ引起的 AT1R内吞的影响。 结果 1、莲心碱抗高血压、保护血管功能的药效作用：莲心碱可以抑制 Ang Ⅱ引起的小鼠血压升高，同时对血管收缩、血管炎症、表型转化及血管重构等血管功能障碍有显著的改善作用。 2、莲心碱保护血管功能的药效机制研究：体内外实验结果显示，莲心碱可显著抑制 Ang Ⅱ引起的 Ca2+信号、NF-κB 信号、MAPK 信号、TGF-β/Smads 信号通路的激活（所有展示的技术指标 P＜0.05）；同时显著抑制因 Ang Ⅱ刺激导致的表型转化标志物α-SMA蛋白水平的下调及PCNA蛋白表达水平的升高（P＜0.05）；通过抑制网格蛋白内吞可降低莲心碱舒张血管环的效果（P＜0.05）。 3、AT1R内吞关键分子Rab5a调控高血压的作用及分子机制：Rab5a缺失可显著促进 Ang Ⅱ引起的血压升高（P＜0.05），加剧血管功能障碍和病理损伤；其分子机制是通过抑制 AT1R的内化和降解而增多其在膜表面的受体数量；相反，Rab5a过表达可抑制 Ang Ⅱ引起的小鼠血压升高（P＜0.05），同时 Rab5a 过表达可显著减少 AT1R 膜蛋白的表达水平，抑制Ang Ⅱ引起的血管收缩进而抑制高血压的发生发展。 4、莲心碱对 Rab5a表达及 AT1R胞内转运的调控作用：莲心碱单独干预可显著增加血管平滑肌细胞中 Rab5a 的基因表达及蛋白合成水平；莲心碱干预在时间和程度上均可促进 Ang Ⅱ诱导的 AT1R内吞，显著减少细胞膜上的 AT1R水平从而抑制 Ang Ⅱ的刺激效应。 结论 1、莲心碱不仅能抑制血压升高，而且能通过抑制血管收缩、血管炎症、表型转化及血管重构改善血管功能异常。 2、莲心碱血管功能的保护作用可能是通过调控 Ca2+信号通路、NF-κB信号通路、MAPK信号通路和TGF-β/Smads信号通路。 3、通过敲除和过表达 Rab5a，揭示 Rab5a是调控 AT1R胞内转运从而调节血压的关键靶点。 4、上述信号通路是 Ang Ⅱ/AT1R 的共同下游。莲心碱可通过提高 Rab5a 的基因及蛋白表达，促进AT1R内吞，抑制Ang Ⅱ信号通路的激活。 本研究系统阐释了莲心碱抗高血压、保护血管功能的作用及机制；首次证明莲心碱可通过提高Rab5a的基因和蛋白表达水平促进AT1R胞内转运，这是莲心碱抗高血压及保护血管功能的新靶点和新机制；并且首次同时在敲除及过表达 Rab5a 的高血压小鼠中证明了 Rab5a 对血压的调控作用。研究结果不仅可进一步丰富高血压的发病机制和莲心碱抑制高血压的作用机制，还可为临床治疗高血压提供更多的思路和方向，并为莲心碱的临床抗高血压应用提供实验依据。
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