摘要
伤口愈合是以止血、炎症、增殖和重塑为基础的时空调节过程。对于口腔急性伤口而言，至关重要的是对开放的伤口组织进行关闭，以避免唾液、食物、微生物的刺激及口腔活动的影响，同时控制急性炎症反应，以允许早期组织形成和重塑。与缝线和缝钉这类传统的伤口管理策略相比，组织粘合剂具有手术时间短，操作简单，侵入性小等多重优势，可实现伤口组织的及时有效闭合。但现有的组织粘合剂对湿组织的粘附力不足，缺乏抗炎作用，限制了其在口腔伤口的应用。因此，设计一种具有组织湿粘附特性的局部抗炎药物递送系统，在有效闭合组织缺损的同时实现局部抗炎效果，对于管理口腔急性伤口意义重大。邻苯二酚材料体系具有独特的湿粘附性，其中，单宁酸（TA）作为一种高度生物活性的天然多酚，可以与各种大分子，尤其是蛋白质发生偶联，为解决上述问题提供了突破口。 目的： 为解决现有组织粘合剂难以在潮湿、动态的口腔环境中有效闭合伤口的同时在局部输送抗炎药物抑制炎症反应的科学问题，本研究拟在TA-蛋白质网络的基础上设计并合成一种集具组织湿粘附、局部炎症调控的湿粘附水凝胶抗炎载药系统（TSD），探究该湿粘附水凝胶体系在口腔伤口局部应用的可行性，并通过细胞实验、动物实验探究其局部抗炎作用，为临床上管理拔牙创等口腔急性伤口提供新思路。 方法： 1. TSD 水凝胶的制备及基础表征。根据课题组前期合成方法从蚕茧中提取丝素蛋白（SF），将双氯芬酸钾（DP）溶于SF溶液得到不同浓度的SF-DP溶液，再与TA溶液按不同体积比通过一步法混合，交联得到不同配比的TSD水凝胶。通过观察TSD冻干后的微观形貌、化学结构、元素组成来证明湿粘附水凝胶体系的成功构建和抗炎药DP的负载。 2. TSD 水凝胶口腔应用的相关性能研究。通过万能力学测试、质构仪测试其在血液中对猪颊黏膜组织的湿粘附强度；通过爆破压力测试检测其密封性；通过流变学表征及注射实验验证材料的可注射性、机械强度及自修复性；通过CCK-8及细胞活/死染实验检测其细胞相容性；通过在不同时间取出TSD水凝胶进行冻干后称重分析其降解曲线。 3. TSD 水凝胶释药性和抗炎性能的体外实验。AAS 测定上清液中的 K+浓度以计算DP的释放率；体外细胞实验通过测定mRNA水平、蛋白水平表达检测 TSD 对Raw 264.7 细胞炎症状态的抑制能力。 4. TSD 水凝胶治疗口腔急性伤口的动物实验。建立大鼠体内拔牙创模型，通过大体照片观察材料充填伤口的适应性及粘附组织的持续性，通过组织切片、组织学染色、免疫组化分析表征TSD的局部抗炎性能；建立大鼠断尾模型测试TSD的止血性能。 结果： 1. TSD 水凝胶的制备及基础表征：不同质量的 DP 溶于 SF溶液（10 wt%）获得的 SF-DP 溶液（0 mg/mL、1 mg/mL、4 mg/mL、7 mg/mL、10 mg/mL，10 mg/mL 为最大溶解度）与 TA 溶液（10 wt%）以 6/4、5/5、4/6、3/7、2/8 的体积比混合，通过β-折叠的蛋白质构象变化，形成具有典型疏松多孔结构的水凝胶网络。TA-SF-DP（TSD）水凝胶具有延展性、可塑性和自修复性，并且成功负载了抗炎药DP，其中包载的DP以无定形分散状态存在。 2. TSD 水凝胶口腔应用的相关性能研究：TSD 水凝胶在血液环境中对口腔黏膜软组织具有牢固的粘附能力和密封性，其中VTA/V(SF-DP)-7/3组展现出最佳的剪切粘接强度。此外，TSD水凝胶还具备可注射性、高机械强度和自修复性。细胞相容性实验证实TSD对成骨细胞和成纤维细胞均未见明显细胞毒性。负载不同浓度DP的TSD水凝胶间机械性能和生物相容性无明显差异。蛋白酶XIV环境中，TSD10水凝胶在2周左右完全降解，与组织再生过程相匹配。获得初始抗炎药物浓度较高的TSD10水凝胶组进行后续实验。 3. TSD 水凝胶释药性和抗炎性能的体外实验：TSD10 水凝胶在 24 h 内快速大量释放药物，与急性炎症反应在最初 24 h 持续处于严重状态的病理生理学特征相匹配。相较于LPS刺激组，LPS+TSD10组在mRNA水平和蛋白水平均下调了巨噬细胞炎症相关因子的表达，初步证明了其抗炎能力。 4. TSD 水凝胶治疗口腔急性伤口的动物实验：TSD10 水凝胶可以适应性充填不规则的大鼠拔牙创，并在口腔环境中粘附至少 24 h 不脱落，H＆E 染色表明TSD10水凝胶处理后，牙龈和牙槽窝位点的炎症细胞密度较空白对照组降低至少60%，免疫组织化学染色直观地表明TSD10水凝胶组炎症因子COX-2、IL-1β和TNF-α的水平较对照组均下调，进一步证实了TSD10水凝胶对炎症的局部调控作用。与纱布组相比，TSD10水凝胶组将止血时间缩短近80%，出血量减少90%。 结论： 综上，本课题成功制备了湿粘附水凝胶抗炎载药系统 TSD10（V10 wt% TA/V(10 wt% SF-10 mg/mL DP) = 7/3），实现了在血液环境中对组织的湿粘附和抗炎药的局部释放，在体外、体内急性炎症模型中显著下调相关炎症因子水平，并展现出优秀的止血能力。该水凝胶载药系统实现了在潮湿的口腔环境中有效闭合伤口以及局部抗炎、止血作用，具有广阔的临床应用前景，有望为口腔急性伤口管理策略的发展提供新思路。
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