摘要
全球老龄化现象日益严峻，老年人群骨骼肌功能、质量的增龄性下降增加肌少症的患病风险，影响老年人身体健康与生活质量，但因为肌少症发病机制复杂，目前尚无有效的药物干预手段。褪黑素作为内源性抗氧化激活剂，在干预肌少症方面显示较好的应用前景，但还需进一步探索其有效剂量及内在生物学机制。 研究目的：本研究主要目的是探索不同浓度褪黑素对肌少症小鼠骨骼肌功能的改善状况、褪黑素对肠道菌群的调节作用以及骨骼肌功能改善与肠道菌群变化是否存在相关性，进而确定褪黑素应用的最佳剂量，提出预防与缓解肌少症的新思路和实验依据，为促进老年人身体健康发展贡献力量。 研究方法： 文献资料法：对褪黑素干预肌少症与肠道菌群相关机制进行深入学习、整理，以确定研究思路和整体实验设计。 实验法：实验对象为雄性C57BL/6J小鼠，分为空白对照组、模型组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组。肌少症造模（地塞米松注射法）结束后对小鼠进行躯体功能检测，评估造模是否成功。造模评估完成后将成模小鼠分别进行不同剂量褪黑素干预（5, 10, 20mg/kg/day），1次/日，共8周。干预结束后对小鼠进行躯体功能测试。测试完成后每组取3只小鼠麻醉后进行全身灌注固定，取小鼠腓肠肌、胫骨前肌与比目鱼肌进行病理切片检测，计算骨骼肌横截面积。每组剩余小鼠麻醉后称重取材。小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）与丙二醛（MDA）含量使用生化剂盒检测。使用蛋白免疫印迹检测小鼠骨骼肌中Nrf2、Keap1、HO-1、Bax及Bcl2表达。使用16SrRNA高通量测序技术，对比分析各组间肠道菌群的多样性和物种组成结构。所有实验数据运用spss 27.00版进行统计分析。 研究结果： 1.肌少症造模结果显示： 地塞米松注射后一周，小鼠躯体运动功能明显下降，与对照组比，造模组小鼠相对抓力极显著下降（P＜0.01）、翻转倒立掉落潜伏期极显著下降（P＜0.01）说明肌少症造模成功。 2.八周不同剂量褪黑素干预结果显示： 小鼠躯体功能结果：体重结果显示，与对照组比，模型组小鼠体重明显下降；与模型组比，中剂量组小鼠体重显著上升（P＜0.05）。相对抓握力结果显示，与对照组比，模型组小鼠相对抓握力显著下降（P＜0.05）；与模型组比，低、中、高3组小鼠相对抓握力均极显著上升（P＜0.01）。翻转倒立掉落潜伏期结果显示，与对照组比，模型组小鼠翻转倒立掉落潜伏期极显著下降（P＜0.01）；与模型组比，中、高剂量组小鼠显著上升（P＜0.05）。 小鼠骨骼肌指数结果：腓肠肌指数显示，模型组小鼠的腓肠肌指数与对照组相比显著下降（P＜0.05）；低剂量组小鼠腓肠肌指数与模型组比显著上升（P＜0.05），中、高剂量组小鼠腓肠肌指数与模型组比极显著上升（P＜0.01）。胫骨前肌指数显示，模型组小鼠胫骨前肌指数与对照组比显著下降（P＜0.05）；与中剂量组小鼠胫骨前肌指数与模型组比显著上升（P＜0.05）；比目鱼肌指数组间无显著差异。 小鼠骨骼肌病理切片结果：腓肠肌横截面积显示，与对照组比，模型组小鼠腓肠肌的横截面积显著下降（P＜0.05）；与模型组小鼠比，低、高剂量组小鼠腓肠肌的横截面积显著上升（P＜0.05），中剂量组小鼠出现了极显著上升（P＜0.01）。胫骨前肌横截面积显示，与对照组比，模型组小鼠的胫骨前肌横截面积表现出下降趋势；与模型组小鼠相比，中、高剂量组小鼠胫骨前肌横截面积显著上升（P＜0.05）；比目鱼肌横截面积组间无显著差异。 小鼠免疫印迹结果：Nrf2相对含量结果表示，与对照组比，模型组小鼠Nrf2的相对含量极显著下降（P＜0.01）；与模型组比，中、高剂量组小鼠Nrf2相对含量显著上升（P＜0.05）。Keap1相对含量结果表示，与对照组比，模型组小鼠Keap1相对含量明显上升；与模型组比，中、高剂量组小鼠Keap1相对含量极显著下降（P＜0.01），低剂量组小鼠Keap1相对含量显著下降（P＜0.05）。HO-1相对含量结果表示，模型组小鼠HO-1相对含量与对照组比显著下降（P＜0.05）；中剂量组小鼠HO-1相对含量与模型组比极显著上升（P＜0.01），高剂量组小鼠HO-1相对含量显著上升（P＜0.05）。Bax相对含量结果表示，与对照组比，模型组小鼠Bax相对含量显著上升（P＜0.05）；与模型组比，中剂量组小鼠Bax相对含量极显著下降（P＜0.01），高剂量组小鼠Bax相对含量显著下降（P＜0.05）。Bcl2相对含量结果表示，与对照组比，模型组小鼠Bcl2相对含量非常显著下降（P＜0.01）；与模型组比，低、中、高剂量3组小鼠Bcl2相对含量显著上升（P＜0.05）。 小鼠血清生化指标结果：超氧化物歧化酶（SOD）结果显示，与对照组比，模型组小鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性显著下降（P＜0.05）；与模型组比，中、高剂量组小鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性显著上升（P＜0.05）。还原型谷胱甘肽（GSH）结果显示，与对照组比，模型组小鼠还原型谷胱甘肽（GSH）含量出现下降趋势；与模型组比，中剂量组小鼠的还原型谷胱甘肽（GSH）含量极显著上升（P＜0.01）；低、高剂量组小鼠出现显著上升（P＜0.05）。丙二醛（MDA）结果显示，与对照组比，模型组小鼠丙二醛（MDA）含量出现极显著上升（P＜0.01）；中剂量组小鼠丙二醛（MDA）含量与模型组比出现极显著下降（P＜0.01）；低、高剂量组小鼠丙二醛（MDA）含量出现显著下降（P＜0.05）。 小鼠肠道菌群结果：α多样性结果显示肠道菌群相对丰度与多样性没有出现显著变化，但β多样性结果显示各组间菌群构成出现显著差异（P＜0.01）；门水平与属水平物种分布结果显示褪黑素干预明显改变了小鼠肠道菌群的物种构成；属水平相对丰度 TOP20 的菌属中，异杆菌属（ Allobaculum ）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、拟普雷沃菌属（Alloprevotella）巴恩斯氏菌属（Barnesiella）、艾森伯格氏菌（Eisenbergiella）、内脏臭杆菌（Odoribacter）、拟杆菌属（Bacteroides）出现显著差异（P＜0.05）。其中异杆菌属（Allobaculum）相对含量与小鼠翻转倒立掉落潜伏期及腓肠肌指数存在显著的正相关关系（ P＜0.01 ， R=0.658 ， R=0.597），拟杆菌属（Bacteroides）相对含量与翻转倒立掉落潜伏期、巴恩斯氏菌属（Barnesiella）相对含量与变速转棒疲劳测试结果存在显著负相关关系（P＜0.05，R=0.524，R=0.512）。 研究结论： 1.八周不同剂量褪黑素干预可显著改善肌少症小鼠躯体运动功能、骨骼肌质量与形态，其中，中等剂量褪黑素干预效果更显著，并且对腓肠肌与胫骨前肌的干预效果显著高于比目鱼肌。 2.褪黑素干预肌少症可能是通过降低氧化应激反应、抗凋亡途径发挥作用，在褪黑素影响下，小鼠抗氧化因子水平显著上升，抗凋亡蛋白的表达增加。 3.八周不同剂量褪黑素干预后小鼠肠道菌群构成发生明显变化。β多样性中各组间菌群构成出现显著差异。部分益生菌出现显著上升，条件致病菌出现显著下降。并且部分益生菌相对含量与骨骼肌功能存在显著正相关性关系，部分条件致病菌相对含量与骨骼肌功能存在显著负相关关系。提示褪黑素可能通过影响肠道菌群来发挥干预肌少症的作用。
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