摘要
大黄鱼（Larimichthys crocea）素有中国“国鱼”之称，肉质鲜美，营养丰富，经济价值高，是我国近海特有和养殖产量最高的海水经济鱼类之一。由于在体研究受到时间、空间和实验取材的极大限制，成为制约研究大黄鱼生长发育及分化、遗传育种、疾病防控等机制的瓶颈之一。诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）技术是研究细胞分化过程、解析细胞分化调控机制的新兴手段之一。本论文以大黄鱼肌肉细胞（LYCMs）为材料，采用电转染方法优化转染体系，在细胞水平上分别过表达大黄鱼4种多能性因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc（OSKM），初步探究OSKM的表达调控作用；通过电转染多种转录因子组合探究不同转录因子组合对大黄鱼LYCMs重编程的作用；通过碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色以及转录组测序等方法鉴定大黄鱼iPSCs；还通过生物信息学、实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）及细胞水平实验分析了大黄鱼重要的多能性因子Nanog基因（Lc-Nanog）的结构特征、表达模式及调控作用；最终构建了基于大黄鱼LYCMs的iPSCs体外诱导体系。主要研究结果如下： 1. 对LYCMs转染体系进行了优化。改良后的L-15细胞培养液更有利于LYCMs的增殖；击穿电压为150 V，电击次数为2时，有利于提高外源基因的导入效率。 2. LYCMs分别过表达了OSKM多能性因子。LYCMs中均能观察到明显的绿色荧光，细胞形态发生了不同程度的改变，LYCMs的增殖能力都明显提升，在电转染1-2 d内细胞普遍达到指数增长期；qRT-PCR分析表明，分别过表达外源性因子OSKM，在激活了目的基因表达的同时，还激活了相关内源性多能性因子的表达，特别是都在不同程度上激活了内源性多能性因子Nanog的高表达。 3. 对Lc-Nanog的表达模式及功能进行了研究。半定量PCR（semi-quantitative RT-PCR， sqRT-PCR）和qRT-PCR分析表明，Lc-Nanog基因主要在早期胚胎发育过程中高表达，呈现母源性表达模式；在各成体组织中，主要在性腺特别是卵巢中特异性高表达；干扰Lc-Nanog基因导致LYCMs细胞出现空泡，难以维持正常的生长状态；过表达Lc-Nanog基因使LYCMs细胞的形态更加饱满，生长速度极大提升，Nanog基因的表达量极显著上升，还激活了内源性因子OSKM的表达。 4. LYCMs分别电转染了3组转录因子组合（OSKM、OSKMNL、OSNL）诱导iPSCs。LYCMs细胞都能观察到明显的绿色荧光，细胞的增殖速度加快，其中OSKMNL组的细胞生长速度最快；3组转染组合都能明显激活内源性因子的表达，OSNL组在转染后第5天就能观察到类似iPSCs的细胞克隆开始形成；使用改良的L-15培养基+LIF等生长因子的培养体系成功培养了大黄鱼iPSCs（Lc-OSNL-iPSCs）并可稳定传代。 5. Lc-OSNL-iPSCs鉴别。Lc-OSNL-iPSCs碱性磷酸酶活性强，标志着Lc-OSNL-iPSCs具有多能性；qRT-PCR、免疫荧光染色以及细胞荧光原位杂交结果显示，Lc-OSNL-iPSCs表达多种多能性因子，如Nanog、Oct4和Sox2等，喻示Lc-OSNL-iPSCs具有多能性。 6. 对转染不同转录因子组合诱导的iPSCs进行了转录组测序分析。各个样本的基因表达量的整体分布情况及主成分分析结果显示，OSNL-iPSCs、OSKMNL-iPSCs、LYCMs各组间都存在差异；差异基因主要分布在蛋白磷酸化、调节转录、信号转导等生物过程，以及细胞周期、细胞因子与受体的相互作用、细胞衰老、细胞粘附分子、DNA复制等信号通路中；主要差异基因的qRT-PCR表达结果与转录组数据中基因上下调的表达趋势基本一致；调节干细胞多能性的信号通路中的一些与维持细胞多能性有关的基因（Nanog、Klf4、Myc、Stat3、Tcf3等）在iPSCs中的表达上调，也验证了iPSCs的多能性。 综上所述，本论文初步构建了基于大黄鱼LYCMs的iPSCs（Lc-OSNL-iPSCs）体外诱导技术体系，探索了大黄鱼多能性因子Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、Nanog（OSKMN）的表达调控网络，为解析大黄鱼生长发育及分化、遗传育种、疾病防控等机制研究提供了新的策略模式和研究模型，为鱼类iPSCs的研究奠定了基础。
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