摘要
研究背景 Toll样受体 (Toll like receptors， TLRs) 是一类模式识别受体，识别与宿主不同的病原体分子，触发机体产生免疫反应。目前已知的 TLRs有 TLR1-13等 13个成员，其中TLR10为人 独 有， TLR11/12/13为 小 鼠 独 有；TLR1/2/4/5/6/11位 于 细 胞 膜 表 面， TLR3/7/8/9/13位于内体膜表面。TLRs在炎症、免疫细胞调控、存活和增殖方面等生物学中发挥重要作用。研究表明，TLR4主要在单核细胞、巨噬细胞中表达，并通过激活 NF-κB或 JNK/SAPK等途径发挥杀伤病原体，抵抗外源性致病菌作用。然而，其在乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤组织中的表达特征仍不清楚。TLR4是炎症过程的重要信号受体，TLR4激动剂脂多糖 (Lipopolysaccharide,LPS)、脂磷壁酸 (lipoteichoic acid,LTA) 等可通过激活细胞膜 TLR4受体，触发胞内NF-κB、JNK/SAPK等信号，并调控炎症因子释放，诱导机体产生免疫应答等过程。 在炎症和肿瘤发生发展过程中，受到局部微环境刺激，巨噬细胞可极化成 M1型，发挥促进病原体清除和肿瘤细胞杀伤作用；亦可极化成 M2型，发挥抑制炎症和促进细胞增殖、迁移和新生血管形成的作用。因此，M1/M2型巨噬细胞极化平衡是调控机体炎症反应和肿瘤免疫微环境的重要因素。NF-κB、MAPK、mTOR等信号在巨噬细胞极化调控过程中发挥重要作用。 最新研究发现，DYRK1A是非经典 NF-κB信号的重要调控分子，可通过非经典 NF-κB途径调控 B细胞中 DYRK1A-TRAF3-NIK等分子复合体的形成，进而影响 p52/RelB的入核，抑制细胞增殖。然而，DYRK1A是否可调控 LPS/TLR4介导的巨噬细胞极化和炎症应答，其在机体炎症损伤和肿瘤进展中的作用如何，这些问题仍不清楚。 目的 本研究拟通过乳腺癌和肺癌生物信息学数据分析、构建 DYRK1A巨噬细胞特异性基因敲除小鼠模型、DYRK1A基因敲除的巨噬细胞模型等技术手段，探讨 TLR4在乳腺癌、肺癌组织中的表达特征及其与肿瘤进展的关系，明确 DYRK1A在 LPS/TLR4信号诱导炎症信号应答和巨噬细胞极化中的作用及其对机体炎症损伤和肿瘤进展的影响。 方法 1 ．利用生物信息学方法分析 TLR4在乳腺癌和肺癌组织中的表达特征：UALCAN公共数据平台 (https://ualcan.path.uab.edu ) (数据来自 TCGA数据库) 分析 TLR4基因在乳腺癌和肺癌患者癌组织和癌旁组织中的表达特征；Kaplan-Meier Plotter公共数据平台(http://kmplot.com) 分析 TLR4基因的表达水平与肿瘤患者生存期、免疫治疗疗效的关系；The Human Protein Atlas公共数据平台 (https://www.proteinatlas.org/) 分析 TLR4基因在不同类型免疫细胞中的表达特征；生信分析工具 (https://www.xiantao.love/) 分析肿瘤组织中 TLR4基因表达水平与免疫细胞浸润的关系。 2 ．构建巨噬细胞特异性 DYRK1A基因敲除小鼠 (Macrophage specific DYRK1A gene knockout mice ，DYRK1A-MKO) ，应用性别和周龄匹配的野生型 (Wild type ，WT) 和DYRK1A-MKO小鼠进行实验，PCR鉴定小鼠基因型；培养 WT和 DYRK1A-MKO小鼠原代骨髓巨噬细胞 (Bone marrowderived macrophages，BMDM) ，应用 TLR4激动剂 LPS处理细胞，Western bolt检测 TLR4下游信号通路NF-κB、ERK活化情况，RT-PCR检测巨噬细胞极化相关基因的表达。 3 ．应用 WT和 DYRK1A-MKO小鼠构建 LPS诱导急性肺损伤模型，组织形态学观察肺损伤程度和炎细胞浸润情况，鼠尾静脉注射 Evans-Blue试剂评估肺血管通透性，检测肺组织湿-干重比值，评估肺水肿严重程度；收集肺泡灌洗液，流式细胞术分析炎细胞浸润情况，ELISA检测炎症因子合成和释放情况。 结果 1 ．利用UALCAN网络平台分析 TLR4在乳腺癌、肺癌中的表达水平 (数据来自TCGA数据库) ，结果显示，TLR4 mRNA在乳腺癌组织、肺癌组织、结直肠癌组织、前列腺癌组织、肝细胞癌组织中的表达水平均显著低于癌旁组织 (P＜ 0.05)；Kaplan-Meier生存分析显示，TLR4高表达组乳腺癌 (2032例)、肺癌 (1925例)、肝细胞癌(364例) 患者总生存期 (overall survival，OS) 显著高于低表达组 (P＜0.001)；进一步分析接受免疫治疗的肿瘤患者 (泛癌，包括膀胱癌 (90例)、食管腺癌 (103例)、胶质母细胞瘤 (28例)、肝细胞癌 (22例)、头颈部鳞状细胞癌 (110例)、黑色素瘤( 570例 )、非小细胞肺癌 ( 21例 )、尿路上皮癌 ( 338例 ) ) 无进展生存期(Progression-free survival，PFS) ，TLR4高表达组 PFS显著高于低表达组 (P＜0.01)。利用The Human Protein Atlas公共数据平台 IMMUNE CELL模块分析 TLR4在不同细胞中的表达水平，结果显示，TLR4主要在单核-巨噬细胞中表达。进一步利用生信分析工具分析 TCGA数据库中 TLR4在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤浸润免疫细胞的关系，结果显示，在乳腺癌、肺腺癌、肺鳞癌、结直肠癌、前列腺癌和肝细胞癌组织中，TLR4表达水平与巨噬细胞、CD8+T细胞、中性粒细胞、DC细胞浸润呈正相关 (cor为正值，P＜0.05)。以上结果提示，TLR4在乳腺癌、肺腺癌、肺鳞癌、结直肠癌、前列腺癌和肝细胞癌中的表达与巨噬细胞等肿瘤免疫细胞浸润密切相关，TLR4可能通过调控肿瘤浸润免疫细胞功能影响肿瘤进展。 2 ．利用GEPIA数据平台分析 TCGA数据库来源乳腺癌、肺腺癌、肺鳞癌、前列腺癌和肝细胞癌中TLR4基因与 DYRK1A基因表达相关性，结果显示，在肿瘤组织中， TLR4基因与 DYRK1A基因表达呈正相关 (R为正值，P＜0.05)。 3 ．分离培养 WT和 DYRK1A-MKO小鼠原代 BMDM细胞，应用TLR4特异性激动剂 LPS刺激细胞 2小时、6小时，提取细胞总 RNA，RT-PCR检测细胞极化标志基因表达情况。结果显示，与 WT组细胞相比，DYRK1A-MKO组 BMDM中 M1型标志基因 IL-1β、IL-12α、IL-12β、TNF-α表达显著增高，M2型标志基因 IL-10表达显著下降；LPS刺激细胞 4小时和 24小时后，提取细胞总蛋白，Westen印迹分析检测巨噬细胞极化相关信号通路活化情况，结果显示，与 WT组相比，DYRK1A-MKO组细胞非经典 NF-κB信号分子p100活化和 p52生成情况无显著变化；刺激 15min、30min、60min后提取胞浆、胞核蛋白，结果显示，DYRK1A-MKO组细胞经典 NF-κB信号分子 RelA、p50在 LPS刺激后入核，蛋白在胞核中出现累计，刺激 15min、30min后提取蛋白，结果显示，DYRK1A-MKO组细胞 p-ERK表达水平显著下调。这些结果表明，DYRK1A基因缺失促进巨噬细胞向 M1型极化并抑制其向 M2型极化。 4 ．应用 LPS气道滴注法构建小鼠急性肺损伤模型，肺组织切片病理学观察结果显示， DYRK1A-MKO小鼠肺组织炎细胞浸润和炎症损伤程度显著高于 WT小鼠；流式细胞术分析肺泡灌洗液中免疫细胞含量和构成，结果显示，DYRK1A-MKO小鼠肺泡灌洗液中细胞总数显著高于 WT小鼠，其中，CD11b+Gr-1+髓系细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞等炎性细胞百分比和细胞数均显著高于对照组 WT小鼠；此外，ELISA法检测肺泡灌洗液中炎症因子水平，结果显示，DYRK1A-MKO小鼠肺泡灌洗液中促炎细胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著高于对照组。这些结果提示，巨噬细胞特异性 DYRK1A基因缺失，导致 LPS诱导的小鼠急性肺损伤反应加重，其原因可能是由于 DYRK1A基因缺失引起NF-κB信号异常活化，促进巨噬细胞向 M1型极化所致。 结论 1 ．TLR4在乳腺癌、肺腺癌、肺鳞癌、结直肠癌、前列腺癌和肝细胞癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织，TLR4在肿瘤组织中的低表达与患者不良预后有关； 2 ．TLR4主要表达于单核巨噬细胞中，肿瘤组织中 TLR4的表达水平与肿瘤组织浸润巨噬细胞、CD8+T细胞、DC细胞呈正比； 3 ．肿瘤组织中，NF-κB相关因子 DYRK1A与 TLR4表达呈正相关；DYRK1A基因缺失抑制 ERK磷酸化，促进 LPS诱导的 M1型巨噬细胞标志基因表达和炎症因子合成释放； 4 ．巨噬细胞特异性敲除 DYRK1A基因的小鼠，LPS诱导的急性肺损伤加重，肺组织炎性细胞浸润增加。
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