摘要
背景与目的： 随着人民生活水平的不断提高，饮酒者日益增多，据世界卫生组织2018年统计，全球约有300万人死于过量饮酒。酒精性肝病（alcoholicliverdisease，ALD）是大量且长期持续饮酒所致的一种进行性加重的肝脏疾病，可从初阶段的脂肪变性进展为肝炎、肝纤维化和肝硬化，严重时可诱变为肝癌。ALD是由酒精及其代谢物、酒精触发的危险分子和肠源性内毒素等直接作用介导的细胞应激驱动。最近研究证明，慢性酒精暴露的机体存在自噬失调，加重肝细胞损伤。ALD因其较高的发病率和死亡率已严重危害人类健康，国内外研究者正在积极探寻影响ALD的相关机制以及预防或改善其损伤的天然药物。岩藻多糖是一种从海藻中提取的硫酸多糖，具有降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗炎以及调节自噬等多种活性，研究报道称岩藻多糖可通过调控自噬过程来减轻肝纤维化，岩藻多糖是否可通过调节自噬减轻酒精性肝损伤还需进一步研究。本研究以低分子量岩藻多糖为干预物，分别建立HepG2细胞酒精性损伤和小鼠酒精性肝损伤模型，进行细胞水平和动物水平干预，探讨其对酒精性肝损伤的改善活性及作用机制，为酒精性肝损伤的预防和治疗提供实验依据。 方法： 1.体外实验：以HepG2细胞株为研究对象，将其分为对照组（Control）、模型组（Model，2.5%酒精）和低剂量岩藻多糖组（F1，10μg/mL）和高剂量岩藻多糖组（F2，20μg/mL）、雷帕霉素组（10nm），岩藻多糖（F2，20μg/mL）+氯喹（CQ）组（150μM），除对照组外，其他各组均加入溶度为2.5%的无水乙醇干预24h，诱导酒精性细胞损伤，再采用MTT比色法、酶联免疫吸附测定（ELISA）法、免疫荧光和Westernblot等方法对相应指标进行检测，观察岩藻多糖干预对酒精处理的HepG2细胞活性的影响，并探讨岩藻多糖体外改善肝细胞损伤的作用机制。 2.体内实验：将30只SPF级雄性C57BL/6小鼠（8周龄）按体重随机分成3组，每组10只，分别为正常对照组（NC：生理盐水），酒精模型组（MC），岩藻多糖干预组（FC）。每天用50%（v/v）8mL/kg.BW的乙醇对模型组和岩藻多糖组的小鼠进行灌胃2周，然后再用12mL/kg.BW的乙醇对模型组和岩藻多糖组的小鼠继续灌胃6周，建立MC和FC组酒精性肝损伤小鼠模型，同时，在酒精灌胃2h后给与岩藻多糖组小鼠灌胃300mg/kg.BW岩藻多糖（溶解于生理盐水），1次/d，对照组小鼠给予等量的生理盐水灌胃8周。用ELISA试剂盒检测血脂、转氨酶以及炎症因子等生化指标，对小鼠肝组织进行组织病理学和超微结构等观察，采用Westernblot、免疫荧光等方法检测各组小鼠肝组织中mTORC1、p70S6K、p62、LC3BⅡ和TFEB的蛋白表达水平。 结果： 体外实验： 1.酒精溶度筛选结果表明，2.5%的酒精溶度干预HepG2细胞24h，可达到细胞半数抑制浓度（IC50）。另外，MTT结果表明10和20μg/mL的岩藻多糖提高酒精暴露下HepG2细胞存活率最佳。 2.ELISA检测结果表明酒精干预后ALT和AST水平均升高（P＜0.001），同时炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平也升高（P＜0.001），而岩藻多糖干预后转氨酶ALT和AST水平降低（P＜0.01或P＜0.001）；炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平均显著下降（P＜0.01）。雷帕霉素干预后也降低了转氨酶和炎性因子水平（P＜0.01或P＜0.001），岩藻多糖联合CQ组干预后也有降低效果（P＜0.01或P＜0.001），表明岩藻多糖可以逆转CQ的干预效果。 3.免疫荧光结果表明，酒精干预后明显下调HepG2细胞LC-3蛋白的表达，而岩藻多糖干预后明显上调细胞LC-3蛋白的表达，与雷帕霉素干预效果相似。此外，岩藻多糖联合CQ组的荧光强度也显著高于酒精模型组，其也上调了LC-3蛋白的表达。Westernblot结果表明，酒精干预后明显下调Beclin1的表达，而岩藻多糖干预后上调Beclin1的表达（P＜0.05）。 体内实验： 1.HE染色结果显示，酒精模型组肝细胞肿胀，出现Mallory小体，伴有脂肪变性，中央静脉和小叶中央区域可见炎性细胞浸润。岩藻多糖干预后，肝细胞细胞质中的Mallory小体和脂肪滴较少，肝索排列整齐，组织结构趋于正常。TEM电镜显示，酒精处理使线粒体嵴模糊，自噬体减少。岩藻多糖干预后，线粒体嵴清晰，自噬体增多。 2.模型组的ALT和AST水平高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），而岩藻多糖干预后，明显降低ALT和AST水平（P＜0.05）。另外，岩藻多糖干预后明显降低IL-1β、TNF-α和IL-6水平（P＜0.05），而显著增加IL-4的水平（P＞0.05）。 3.酒精处理使TG、TC、LDL-C和TBA水平显著升高（P＜0.05、P＜0.01或P＜0.001）。岩藻多糖干预后显著降低血清TG、TC、LDL-C和TBA水平（P＜0.05）。 4.流式细胞术分析显示，岩藻多糖干预后显著降低Th1、Th2和Th17细胞的比例（P＜0.05）。 5.Westernblot结果显示，岩藻多糖干预可降低p62、mTORC1和p70S6K的蛋白表达（P＜0.05），同时明显上调了TFEB和LC3BⅡ的蛋白表达（P＜0.05）。免疫荧光结果也显示，岩藻多糖干预后，显著上调了LC3B蛋白的表达水平。 结论： （1）体内和体外实验表明，低分子量岩藻多糖对酒精处理的HepG2细胞和ALD小鼠肝组织均具有保护作用。 （2）低分子量岩藻多糖可抑制mTORC1/p70S6K通路，促进自噬，改善HepG2细胞和小鼠肝组织酒精所致的肝损伤。因此合理补充岩藻多糖等海藻类生物活性物质可能是预防ALD的潜在方法。
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