摘要
松材线虫病是由松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）引起的一种系统侵染性病害，可在极短的时间内导致大量松树枯死，对我国森林环境和林业生产危害极大。松材线虫病传播速度快、范围广、防治难度大，目前尚无彻底控制松材线虫病发生与传播的有效方法。马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是松材线虫主要危害对象，且被感染后在短时间内枯死。然而火炬松（P. taeda L.）对松材线虫病表现出了极高的抗性，目前未出现大面积染病死亡的情况。利用种间杂交创制抗松材线虫病新品种可能是防治松材线虫病最经济、最有效的方法之一。因此，本研究利用分子标记技术鉴定马尾松和火炬松真实杂交子代，通过抗性评价筛选出马尾松×火炬松高抗家系。同时，从组织结构、松脂化学组分及差异基因表达水平解析抗性马尾松×火炬松防御松材线虫病的机理，为马尾松×火炬松早期鉴定和抗性研究提供理论基础。主要研究结果如下： （1）通过比对参考基因组油松（P. tabuliformis Carrière）和火炬松基因组序列设计特异性引物，以8个马尾松种源共16个单株（2株/种源）和8个火炬松家系共16个单株（2株/家系）为材料对150对引物进行种间特异性条带筛选，获得12对引物组合可用于马尾松和火炬松杂交子代真实性鉴定。对马尾松和火炬松F1代29个家系共88个植株进行鉴定，其中29个家系的81株鉴定为马尾松×火炬松植株，杂种率为92.05%。对F2代21个家系共688个植株进行鉴定，其中21个家系的279株鉴定为马尾松×火炬松植株，杂种率为40.55%。 （2）对马尾松、火炬松和F1代马尾松×火炬松采割松脂并测定组分类别和含量，分别检测出20、15和20种松脂组分，单萜类、倍半萜类和二萜类含量在马尾松、火炬松和马尾松×火炬松之间存在显著差异（P＜0.01）。其中与抗性相关组分α-蒎烯、长叶环烯、长叶烯在马尾松×火炬松中含量显著高于马尾松与火炬松（P＜0.01），而β-蒎烯与柠檬烯含量显著低于火炬松（P＜0.01），和马尾松无显著差异（P＞0.05）。这表明通过种间杂交能够提升部分与抗性相关松脂组分的含量。 （3）对F2代马尾松×火炬松13个家系接种松材线虫并进行抗病性评价，依据五段法筛选出5个高抗家系和4个易感家系。利用松材线虫染色法发现死亡枝条与存活枝条顶端茎段均存在松材线虫，表明线虫成功侵染，抗性评价结果较为准确。对马尾松、火炬松和F2代马尾松×火炬松组织结构树脂道进行统计分析，在自然条件下，组织结构树脂道平均面积、单位数目和单位面积存在显著差异（P＜0.05），马尾松×火炬松组织结构树脂道呈现面积小、数目多的特征。高抗马尾松×火炬松树脂道单位数目和单位面积均显著高于易感马尾松×火炬松（P＜0.05），表明组织结构树脂道数目和大小与抗性呈正相关关系。 （4）对F2代高抗和易感马尾松×火炬松接种松材线虫，选用接种后0、1和7 d的顶端茎段进行转录组测序，共有2513个差异表达基因（Differential expression genes, DEGs）。接种0 d时，DEGs富集显著性高的通路是淀粉和蔗糖代谢、类黄酮生物合成、植物-病原菌互作和二萜生物合成。接种1 d时，DEGs主要富集在内质网中的蛋白质加工、淀粉和蔗糖代谢、亚油酸代谢和植物-病原菌互作。接种7d时，DEGs富集显著性高的通路是类黄酮生物合成、光合作用、光合作用-天线蛋白和苯丙烷代谢。植物-病原菌互作和MAPK信号通路-植物通路在不同的接种时间里，注释到的差异基因数量较多。针对植物-病原菌互作和MAPK信号通路-植物通路中上调表达基因，进一步以马尾松×火炬松的差异基因构建共表达网络，发现MAPK13基因处于互作网络核心位置，筛选为抗病候选基因。 综上所述，本研究筛选获得12对引物用于马尾松×火炬松杂种鉴定，马尾松和火炬松杂交后代分化现象严重，在育种过程中可走“有性繁育，无性利用”之路。马尾松与火炬松种间杂交能够提升部分与抗性相关松脂组分的含量，有望通过杂交提升对松材线虫的抗病性。筛选出5个对松材线虫具有高抗病性的马尾松×火炬松家系，组织结构结果表明树脂道数目和大小与抗性呈正相关关系。筛选MAPK13作为抗病候选基因。本研究为马尾松×火炬松早期鉴定提供了理论依据，也为抗松材线虫病研究奠定了材料和理论基础。
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